鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在自體移植皮片過(guò)度色素沉著中的作用.pdf

1、一、研究背景
　　 自體皮片移植是整形外科常用手術(shù)方法之一，在修復(fù)創(chuàng)面、改善外形、恢復(fù)功能等方面發(fā)揮了重要作用。但移植皮片成活后常伴有不同程度的過(guò)度色素沉著，從而影響了手術(shù)的美容效果，如何減輕移植皮片后的色素沉著是困擾整形外科醫(yī)生的一大難題。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)α-黑素細(xì)胞刺激素（α-melanocyte-stimulating hormone,α-MSH）在自體移植皮片中呈過(guò)度表達(dá)，通過(guò)與黑素細(xì)胞表面特異性受體－黑皮素-1

2、受體（melanocortin-1receptor, MC-1R）結(jié)合后促進(jìn)黑素細(xì)胞合成黑素增多，并促進(jìn)黑素小體擴(kuò)散，使自體移植皮片呈過(guò)度色素沉著表現(xiàn)。其他作者研究發(fā)現(xiàn)，鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與α-MSH 前體的合成、黑色素合成原材料的供給、黑素細(xì)胞增殖、酪氨酸酶的合成及黑素小體轉(zhuǎn)運(yùn)等多個(gè)環(huán)節(jié)，從而參與調(diào)控黑素細(xì)胞中黑素的合成。還有其他研究表明α-MSH與黑素細(xì)胞表面MC-1R 結(jié)合可使細(xì)胞鈣內(nèi)流增加、胞內(nèi)鈣水平升高，激活細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑

3、。
　　 以上研究說(shuō)明，α-MSH的合成、黑素細(xì)胞中酪氨酸酶的激活、黑素的合成等都需要鈣信號(hào)的參與調(diào)節(jié)；因此，鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在自體移植皮片中對(duì)色素沉著的調(diào)控作用，以及其與α-MSH 促進(jìn)黑素細(xì)胞合成黑色素的通路之間的關(guān)系值得進(jìn)一步研究。
　　 二、研究目的(一) 檢測(cè)CaM、IP3RI及TYR在人體自體移植皮片中的表達(dá)，并與自身正常皮膚作對(duì)照，認(rèn)識(shí)鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在自體移植皮片過(guò)度色素沉著中的作用。
　　 (二)

4、觀察維拉帕米對(duì)人皮膚黑素細(xì)胞胞內(nèi)鈣離子濃度、細(xì)胞的增殖、CaM、TYR、IP3RI的表達(dá)及黑色素合成的影響，探討鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在黑素細(xì)胞合成黑色素中的調(diào)控作用及環(huán)節(jié)。
　　 (三) 觀察維拉帕米與α-MSH 共同作用后對(duì)人皮膚黑素細(xì)胞的增殖、CaM、TYR、IP3RI的表達(dá)及黑色素合成的影響，探討鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與α-MSH在黑素細(xì)胞合成黑色素中相互作用。
　　 (四) 觀察維拉帕米在體內(nèi)對(duì)自體移植皮片色素沉著的影響，進(jìn)一

5、步闡述鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對(duì)自體移植皮片色素沉著中的調(diào)控作用。
　　 三、研究?jī)?nèi)容和方法(一) 利用免疫組織化學(xué)方法和Realtime-PCR 方法分別檢測(cè)自體移植皮片(刃厚、中厚及全厚皮片)與正常對(duì)照皮膚中CaM、TYR及IP3RI的表達(dá)情況，銀染-麗春紅(Masson Fontana-Ponceau)復(fù)合法檢測(cè)自體移植皮片中黑色素的含量，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 (二) 用含不同濃度維拉帕米的條件培養(yǎng)基作用于人皮膚黑素細(xì)胞

6、后，通過(guò)熒光抗體標(biāo)記法檢測(cè)黑素細(xì)胞胞內(nèi)鈣離子濃度、MTT 法觀察人皮膚黑素細(xì)胞的增殖，Western-blot及Realtime-PCR 方法分別檢測(cè)人皮膚黑素細(xì)胞中CaM、TYR及IP3RI蛋白和基因表達(dá)，多巴氧化法測(cè)定TYR 活性的變化及NaOH 裂解法測(cè)定細(xì)胞中黑素的含量，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 (三) 檢測(cè)維拉帕米與α-MSH 共同作用人黑素細(xì)胞后，細(xì)胞增殖、TYR 活性、黑素含量、CaM、TYR及IP3RI的表達(dá)并與

7、對(duì)照組相比較。
　　 (四) 利用免疫組織化學(xué)方法及Realtime-PCR 法分別檢測(cè)維拉帕米作用前后豚鼠自體移植皮片中CaM和TYR的表達(dá)，銀染-麗春紅(Masson Fontana-Ponceau)復(fù)合法檢測(cè)自體移植皮片表皮中黑色素的含量，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 四、研究結(jié)果(一) 應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法，觀察到CaM的表達(dá)定位于表皮基底部黑素細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞胞質(zhì)，TYR的表達(dá)定位于表皮基底部黑素細(xì)胞胞質(zhì)，IP3

8、RI的表達(dá)定位于表皮基底部黑素細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，它們?cè)谧泽w移植皮片中蛋白表達(dá)較正常皮膚明顯上調(diào)；通過(guò)Realtime-PCR 方法檢測(cè)，CaM及TYR基因在自體移植皮片中的表達(dá)較正常皮膚亦明顯上調(diào)。
　　 (二) 維拉帕米能明顯降低黑素細(xì)胞胞內(nèi)鈣離子濃度、抑制黑素細(xì)胞增殖、下調(diào)CaM和TYR的表達(dá)，降低TYR的活性而減少黑色素的合成。
　　 (三) 維拉帕米通過(guò)抑制鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用能拮抗α-MSH對(duì)黑素細(xì)胞合成黑

9、色素的促進(jìn)作用，抑制黑素細(xì)胞增殖、下調(diào)CaM和TYR的表達(dá)，降低TYR的活性而減少黑色素的合成。(四) 利用免疫組織化學(xué)方法及Realtime-PCR 法，在維拉帕米作用后皮片中黑素含量、CaM、TYR的蛋白及基因表達(dá)與未處理組相比均明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而與正常豚鼠相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 五、研究結(jié)論CaM在人自體移植皮片中的表達(dá)顯著增高，刺激皮片黑素細(xì)胞合成黑色素增多，促進(jìn)自體移植皮片過(guò)度色素沉著；維拉帕米作用于