蛋白激酶D1在高血壓左室重塑中的作用及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制研究.pdf

1、高血壓左心室重塑是心臟事件重要的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，與心律失常、猝死、心力衰竭等密切相關(guān)。高血壓病時(shí)心臟的后負(fù)荷增加，血流動(dòng)力學(xué)改變伴隨神經(jīng)-內(nèi)分泌異常，左心室肥厚、心肌纖維化以及心腔擴(kuò)大，此過程即為左心室重塑。早期左室重塑是對(duì)血流動(dòng)力學(xué)負(fù)荷增加的一種適應(yīng)性代償反應(yīng)，能降低室壁張力，維持甚至增加心排血量。但到后期，進(jìn)展到左室肥厚時(shí)則成為危險(xiǎn)因素作為疾病進(jìn)程重要機(jī)制之一，左心室重塑導(dǎo)致了臨床癥狀的惡化，是心力衰竭發(fā)生、發(fā)展的基礎(chǔ)。近年來，隨著分

2、子細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展，對(duì)心衰發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究已有了新的認(rèn)識(shí)，目前認(rèn)為導(dǎo)致心衰不斷進(jìn)展的基本機(jī)制是心肌重塑。心肌重塑是一個(gè)極為復(fù)雜的病理過程，其確切的機(jī)制仍不十分明確，研究發(fā)現(xiàn)，包括神經(jīng)內(nèi)分泌激活、氧化應(yīng)激、細(xì)胞因子的活化等多種因素參與。其中，細(xì)胞因子的活化對(duì)心肌重塑的調(diào)控作用正日益受到重視。高血壓發(fā)展過程中可出現(xiàn)心肌肥厚、心肌纖維化等左室重塑的變化，其發(fā)病機(jī)制以及所涉及的信號(hào)傳導(dǎo)途徑是心血管研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)問題之一。 蛋白激酶D作

3、為一類特殊蛋白激酶家族，從蛋白激酶C家族中獨(dú)立出來，其在細(xì)胞間信息傳遞過程中發(fā)揮的重要作用近幾年才逐漸為我們所認(rèn)識(shí)。PKD家族主要包括PKD1、PKD2，PKD3等三個(gè)成員。作為Ca+/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶，PKD1與PKD3又分別稱作PKCμ和PKCv。有研究發(fā)現(xiàn)，受生長(zhǎng)因子、GPCR拮抗劑、佛波酯等的刺激，PKD活化，PKD1可能參與信號(hào)調(diào)節(jié)激酶ERK和JNK途徑。Friederike等人對(duì)研究表明，腺病毒轉(zhuǎn)染增強(qiáng)成年大鼠心室肌細(xì)

4、胞PKD1表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，PKD1可以使肌鈣蛋白I磷酸化，同時(shí)降低肌絲Ca+的敏感性，提示PKD1調(diào)節(jié)心室肌細(xì)胞的功能。PKD1的活化誘導(dǎo)PKD1的質(zhì)膜轉(zhuǎn)位，通過RIN1磷酸化和封鎖與Ras的結(jié)合激活Ras-Raf-MEK.ERK途徑，可能通過磷酸化C-Jun下調(diào)MEKK-MKK-JNK途徑，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和分化。Fielitz等人發(fā)現(xiàn)PKD1敲除小鼠模型中，PKD1基因缺失使心肌肥厚明顯減輕，心功能有改善。 PKD1在自發(fā)性

5、高血壓大鼠心肌組織中的活性表達(dá)會(huì)是什么樣呢?它是否在左室重塑過程中起到關(guān)鍵作用呢?對(duì)于PKD1在左室重塑中的作用機(jī)制還不是很明確。截止目前，在國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)中尚未發(fā)現(xiàn)對(duì)上述相關(guān)問題的研究。 近年來，對(duì)HMG-CoA還原酶抑制劑--他汀類藥物的研究表明：該類藥物除了本身的降脂效應(yīng)外，還具有獨(dú)立于調(diào)脂以外的多種效應(yīng)。本研究應(yīng)用阿托伐他汀觀察其在自發(fā)性高血壓大鼠動(dòng)物模型中對(duì)SHR左室重塑的影響，評(píng)價(jià)阿托伐他汀在高血壓心肌重塑發(fā)生發(fā)展中的作

6、用，探討他汀類藥物與PKD1通路間的相關(guān)關(guān)系。 目的： 1.驗(yàn)證自發(fā)性高血壓大鼠左室肥厚、心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展； 2.探討蛋白激酶D1在自發(fā)性高血壓大鼠模型心肌組織中的表達(dá)； 3.探討自發(fā)性高血壓大鼠心肌組織的蛋白激酶D1活性表達(dá)與左室肥厚、心肌纖維化的相關(guān)性。 4.評(píng)價(jià)阿托伐他汀在高血壓心肌重塑發(fā)生發(fā)展中的作用及與PKD1的關(guān)系。 方法 8周齡WKY大鼠28只、自發(fā)性高血壓大鼠4

7、1只。WKY大鼠隨機(jī)分為四組，A組：8周齡；B組：16周齡；C組：24周齡，G組：WKY安慰劑。SHR大鼠隨機(jī)分為五組：D組：8周齡；E組：16周齡；F組：24周齡；H組：SHR安慰劑，I組：SHR阿托伐他汀。以標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料喂養(yǎng)及普通飲水。另外，WKY安慰劑組、SHR安慰劑組及SHR阿托伐他汀治療組，每天以蒸餾水或阿托伐他汀分別灌胃，喂養(yǎng)16周。于8、16、24周處死動(dòng)物，留取心肌組織標(biāo)本備用。實(shí)驗(yàn)過程中，進(jìn)行以下檢測(cè)：（1）各組大鼠每

8、隔2周測(cè)量體重及尾動(dòng)脈血壓一次；（2）分別于喂養(yǎng)前、喂養(yǎng)至16周、24周抽血測(cè)定空腹血脂；（3）測(cè)定各組大鼠LVM及LVMI值；（4）分別于實(shí)驗(yàn)開始前、實(shí)驗(yàn)?zāi)┻M(jìn)行常規(guī)超聲心動(dòng)圖檢查，測(cè)定左室舒張末期內(nèi)徑、左室收縮末期內(nèi)徑、室間隔舒張末期厚度、左室后壁舒張末期厚度，同時(shí)計(jì)算相對(duì)室壁厚度（RWT）=（IVSTd+LVPWTd）/LVEDD、左室射血分?jǐn)?shù)；（5）于實(shí)驗(yàn)?zāi)┳鲂募〗M織超微結(jié)構(gòu)和病理學(xué)檢查。（6）Westen blot法檢測(cè)PKD1

9、、p-PKD1744/748、p-PKD1916蛋白的表達(dá)及與心肌肥厚各項(xiàng)指標(biāo)相關(guān)性。（7）心肌膠原定性和定量分析及與PKD1、磷酸化PKD1的相關(guān)性。 結(jié)果： 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物基本情況：實(shí)驗(yàn)過程中共有3只大鼠死亡，WKY大鼠16周齡組一只，SHR大鼠組16及24周齡組各一只。在普通喂養(yǎng)10～24周內(nèi)死亡。SHR阿托伐他汀治療組無死亡。共66只大鼠完成實(shí)驗(yàn)，其中WKY組27只，SHR組39只。 2.各組大鼠基本指標(biāo)比

10、較 喂養(yǎng)前，各組大鼠體重、尾動(dòng)脈收縮壓、血脂均無差異。16周、24周后，與WKY對(duì)照組及8周齡SHR組比較16周SHR組、24周SHR大鼠組尾動(dòng)脈收縮壓升高明顯，差異有顯著性意義：SHR阿托伐他汀治療組尾動(dòng)脈收縮壓較WKY對(duì)照組及8周齡SHR組明顯升高，有顯著性差異，而與16周SHR組水平無明顯差異。 雖然SHR組與WKY組比較，未干預(yù)各組大鼠體重、血甘油三酯、總膽固醇及高密度脂蛋白分別有降低趨勢(shì)，但各組間差異無顯著性統(tǒng)

11、計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。干預(yù)各組大鼠中SHR阿托伐他汀組血清TC，TG及HDL均較WKY安慰劑、SHR安慰劑組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05～0.01）。 3.測(cè)定各組大鼠LVM及LVMI值 隨著周齡的增加，與同齡WKY大鼠比較，SHR大鼠LVM及LVMI值逐漸升高，表明高血壓組大鼠左心室發(fā)生明顯肥厚。SHR阿托伐他汀組與WKY安慰劑組相比，LVM及LVMI值無明顯差異（P>0.05），而與SHR安慰劑組相比

12、具有顯著性差異（P<0.01），表明阿托伐伐他汀對(duì)SHR高血壓的左室肥厚有逆轉(zhuǎn)作用。 4.超聲心動(dòng)圖檢查 分別于喂養(yǎng)前和喂養(yǎng)至16、24周后行超聲心動(dòng)圖檢查。由專人采用美國(guó)CATEMAY超聲診斷儀，測(cè)取連續(xù)3個(gè)心動(dòng)周期的舒張期室間隔厚度（IVSTd）、左室后壁厚度（LVPWT）和左心室舒張未期內(nèi)徑（LVEDD），取其均值。測(cè)定左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）。 SHR大鼠16周齡組與24周齡組IVSd、PWT、LVM、

13、LVMI均較WKY大鼠各周齡組及SHR大鼠8周齡組明顯升高，有顯著性差異（P<0.01）。LVEF各組沒有顯著性差異。阿托伐他汀組IVSd、PWT、LVM、LVMI值與SHR16周組比較無明顯差異，而較SHR24周組明顯減低（P<0.05）。 5.心肌組織病理觀察 HE染色顯示：WKY大鼠組心肌細(xì)胞體積較小，大小均一，飽滿，排列較整齊；SHR大鼠組心肌細(xì)胞體積變大，大小不均一，形態(tài)不規(guī)則，排列紊亂；細(xì)胞壁不完全清楚，細(xì)

14、胞相交處可見融合。隨著周齡的增加，上述心肌細(xì)胞表現(xiàn)愈加明顯。 6.Westen blot檢測(cè)各組心肌組織中PKD1及磷酸化PKD1的表達(dá) 與同周齡WKY對(duì)照組相比，SHR8、16、24周齡組大鼠心肌組織中p-PKD1744/748、p-PKD1916表達(dá)明顯升高（P<0.01）；隨著周齡的增加SHR組p-PKD1744/748、p-PKD1916表達(dá)水平逐漸升高（P<0.01）。同期WKY各組大鼠的p-PKD1744/7

15、48、p-PKD1916沒有顯著性變化。SHR阿托伐他汀組的磷酸化PKD1較SHR24周組的表達(dá)減弱，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。 SHR各組PKD1表達(dá)無明顯變化。 相關(guān)性分析顯示，SHR組p-PKD1744/748、p-PKD1916表達(dá)與IVST、LVM、LVMI呈明顯的正相關(guān)（r=0.74，P<0.01）。 7.心肌纖維化定性及定量分析 Masson染色膠原含量的檢測(cè)：WKY組心肌纖維排列整

16、齊、緊致，小動(dòng)脈周圍少量膠原沉積，但很少向周圍間質(zhì)延伸，心肌間質(zhì)內(nèi)膠原多呈散在或長(zhǎng)條索狀分布；SHR組與WKY組比較，心肌細(xì)胞腫大，肌纖維排列疏松紊亂，血管周圍及心肌間質(zhì)膠原顯著增多，且交聯(lián)成網(wǎng)格狀。阿托伐他汀組心肌細(xì)胞腫大的現(xiàn)象明顯減少。 定量分析心肌組織羥脯氨酸含量、心肌膠原容積分?jǐn)?shù)（CVF）和心肌內(nèi)血管周圍膠原面積（PVCA），并對(duì)所得指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)分析。檢測(cè)結(jié)果為SHR大鼠D、E、F組心肌羥脯氨酸含量隨著周齡的增加。與同齡

17、WKY對(duì)照組相比，SHR16、24周齡組左室心肌組織膠原含量明顯升高（P<0.01）。阿托伐他汀用藥組左室心肌組織膠原含量較SHR24周齡組明顯減低（P<0.05）。 相關(guān)性分析顯示：SHR組大鼠的左室心肌組織膠原含量與周齡及p-PKD1744/748表達(dá)、p-PKD1916表達(dá)、IVST、PWT、LVM、LVMI呈明顯的正相關(guān)（r為0.746，P<0.01），而與PKD1表達(dá)無明顯相關(guān)性。 結(jié)論： 1.SHR大