蛋白激酶D在高血壓主動(dòng)脈重塑中的作用及分子機(jī)制研究.pdf

1、背景：高血壓是心血管疾病最重要的危險(xiǎn)因素，而血管重塑是導(dǎo)致高血壓患者心血管事件發(fā)生率顯著增加的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。與高血壓相伴隨的血管結(jié)構(gòu)和功能的改變即高血壓血管重塑，主要包括管壁增厚、管壁管腔比值增大和小血管減少，以及隨之產(chǎn)生的血管功能異常。血管重塑不僅僅是一種代償反應(yīng)，也是高血壓的主要病理基礎(chǔ)之一，是引起高血壓各種嚴(yán)重并發(fā)癥以及循環(huán)系統(tǒng)功能紊亂的重要原因。血管重塑可導(dǎo)致一系列的臨床事件，如高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化和血管狹窄等。目前的研究表明，

2、高血壓主動(dòng)脈重塑是死亡率增加的主要原因之一。因此預(yù)防和改善血管重塑也是高血壓治療的主要目標(biāo)之一和評價(jià)高血壓治療效果的重要指標(biāo)。血管重塑的發(fā)病機(jī)制和防治措施已成為國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。高血壓血管重塑是一個(gè)非常復(fù)雜的病理過程，其確切的機(jī)制仍不十分明確。研究發(fā)現(xiàn)，血管重塑涉及多個(gè)細(xì)胞過程的變化，如細(xì)胞肥大、增殖、調(diào)亡、重塑、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞因子的活化、細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生與降解等。高血壓主動(dòng)脈重塑的中心環(huán)節(jié)是因血管平滑肌細(xì)胞肥大導(dǎo)致的血管中膜增

3、厚。蛋白激酶D(PKD)家族是一種新發(fā)現(xiàn)的Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴性的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，主要包括PKD1、PKD2，PKD3三個(gè)成員。PKD結(jié)構(gòu)與酶的活性均和PKC家族不同。越來越多的證據(jù)表明，PKD介導(dǎo)的信號通路在心血管系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，尤其在調(diào)節(jié)心肌收縮、心室肥厚及重塑中的作用。最近的研究顯示血管平滑肌細(xì)胞也表達(dá)PKD，且PKD的活性能被一些刺激因素激活，如血管緊張素Ⅱ，血小板源性生長因子和血栓素等。用血管緊張素Ⅱ刺激血管平滑

4、肌細(xì)胞時(shí)，PKD通過ATl/PKCδ途經(jīng)被激活。另外有研究證實(shí)PKD可通過使組蛋白去乙酰酶5(HDAC5)磷酸化介導(dǎo)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞肥大。然而，PKD在自發(fā)性高血壓大鼠主動(dòng)脈組織中的活性表達(dá)及其在主動(dòng)脈重塑中的作用機(jī)制還不是很明確。高血壓患者經(jīng)常伴隨血脂代謝紊亂，因此他汀類藥物在高血壓患者中應(yīng)用廣泛。越來越多的證據(jù)表明，他汀類藥物除了能夠有效降低血脂水平外，還能發(fā)揮其降脂以外的多項(xiàng)心血管保護(hù)效應(yīng)，如：改善血管內(nèi)皮功能、穩(wěn)

5、定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊、抗炎抗氧化以及阻止心室肥厚、改善心室重塑等。無論患者血脂是否正常，應(yīng)用他汀類藥物均能降低心血管疾病的致殘率和死亡率。最近的研究表明，阿托伐他汀能抑制心肌肥厚及纖維化。然而，它在血管重塑中的保護(hù)作用及其具體機(jī)制還不是很清楚。本課題動(dòng)態(tài)觀察高血壓大鼠主動(dòng)脈組織中PKD表達(dá)和活化特點(diǎn)及其與主動(dòng)脈重塑的關(guān)系；研究PKD在高血壓主動(dòng)脈重塑中的作用機(jī)制；初步探討阿托伐他汀對高血壓主動(dòng)脈重塑的改善作用及其分子機(jī)制。旨在從分子角度闡

6、明高血壓血管重塑的發(fā)病機(jī)制和他汀類藥物改善血管重塑的機(jī)制。為高血壓血管重塑的防治提供新思路和理論依據(jù)。
　　 目的：⑴明確自發(fā)性高血壓大鼠主動(dòng)脈重塑的發(fā)生發(fā)展過程；⑵探討自發(fā)性高血壓大鼠主動(dòng)脈組織中蛋白激酶D的活性表達(dá)在血管重塑中的作用。⑶評價(jià)阿托伐他汀在改善高血壓主動(dòng)脈重塑發(fā)生發(fā)展中的作用及與PKD的關(guān)系。
　　 方法：8周齡WKY大鼠40只、自發(fā)性高血壓(SHR)大鼠50只。WKY大鼠隨機(jī)分為四組，A組：8周齡(n=

7、10只)；B組：16周齡(n=10只)；C組：24周齡(n=10只)，G組：WKY安慰劑(n=10只)。SHR大鼠隨機(jī)分為五組：D組：8周齡(n=10只)；E組：16周齡(n=10只)；F組：24周齡(n=10只)；H組：SHR安慰劑(n=10只)；I組：SHR阿托伐他汀(ATV)50mg·kg-1·d-1(n=10只)。以標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料喂養(yǎng)及普通飲水。另外，WKY安慰劑組、SHR安慰劑組及SHR阿托伐他汀治療組，自16周齡開始每天以蒸餾

8、水或阿托伐他汀分別灌胃，持續(xù)8周。于8、16、24周處死動(dòng)物，留取胸主動(dòng)脈組織標(biāo)本備用。實(shí)驗(yàn)過程中，進(jìn)行以下檢測：(1)各組大鼠每隔2周測量體重、心率及尾動(dòng)脈血壓一次；(2)分別于喂養(yǎng)前、喂養(yǎng)至16周、24周抽血測定空腹血脂；(3)HE、Masson及天狼腥紅染色，觀察主動(dòng)脈壁內(nèi)膜結(jié)構(gòu)、中膜厚度、彈力纖維和膠原沉積變化；(4)測量主動(dòng)脈壁中層厚度(MT)、內(nèi)徑(LD)、膠原體積分?jǐn)?shù)(VFC)，并計(jì)算MT/LD比值；(5)計(jì)算羥脯氨酸含量

9、；(6)ELISA法檢測炎癥因子IL-6和TNF-α；(7)Western blot法檢測硝基酪氨酸、PKD、p-PKD744/748、p-PKD916蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果：①實(shí)驗(yàn)過程中共有2只大鼠死亡，SHR大鼠組16及24周齡組各一只。在普通喂養(yǎng)周期內(nèi)死亡。SHR阿托伐他汀治療組無死亡。共88只大鼠完成實(shí)驗(yàn)，其中WKY組40只，SHR組48只。②喂養(yǎng)前，各組大鼠心率、血脂均無顯著差異(P>0.05)；SHR大鼠尾動(dòng)脈收縮

10、壓高于WKY大鼠，差異顯著(P<0.05)。WKY大鼠的血壓在整個(gè)喂養(yǎng)過程中無明顯升高，與WKY組比較，SHR大鼠血壓隨周齡逐漸升高，差異有顯著性意義(P<0.05)；SHR阿托伐他汀治療組尾動(dòng)脈收縮壓明顯降低，有顯著性差異(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)前各組大鼠血甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)間差異無顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。SHR阿托伐他汀組血清TC及LDL均較WKY安慰劑

11、、SHR安慰劑組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，TG和HDL-C變化不明顯(P>0.05)。③HE染色顯示：WKY大鼠血管壁無明顯增厚，平滑肌細(xì)胞體積較小，大小均一，排列整齊，中膜層彈力纖維排列有序，內(nèi)膜均一，無增厚；SHR大鼠中膜明顯增厚，中膜內(nèi)平滑肌細(xì)胞肥大，形態(tài)不規(guī)則，排列紊亂，彈力纖維層扭曲，內(nèi)皮細(xì)胞排列紊亂，內(nèi)膜略有增厚，部分內(nèi)皮細(xì)胞有脫落。隨著周齡的增加，上述表現(xiàn)愈加明顯。阿托伐他汀組與SHR安慰劑組相比較，內(nèi)、

12、中膜結(jié)構(gòu)均明顯改善，內(nèi)膜較平滑均一，中膜增厚明顯減弱，平滑肌細(xì)胞肥大減退，排列較規(guī)則，中層彈力纖維結(jié)構(gòu)較完整有序。Masson染色顯示：WKY組彈力纖維排列整齊，膠原增生不明顯；SHR組膠原纖維明顯增多，彈力纖維減少、排列紊亂甚至斷裂；阿托伐他汀組與SHR安慰劑組相比較，膠原增生減少，彈力層增多，排列較整齊。天狼腥紅染色顯示：與WKY對照組相比，SHR組隨著周齡增加，Ⅰ型膠原纖維和Ⅲ型膠原顯著增加，阿托伐他汀組比SHR安慰劑組膠原纖維明

13、顯減少。④與WKY組比較，SHR組MT、MT/LD、VFC均顯著增加(P<0.05)；阿托伐他汀組較SHR安慰劑組MT、MT/LD、VFC顯著降低(P<0.05)。⑤WKY大鼠在整個(gè)喂養(yǎng)過程中，羥脯氨酸含量無明顯增加。與WKY組比較，SHR組羥脯氨酸隨周齡顯著增加(P<0.05)；阿托伐他汀組較SHR安慰劑組羥脯氨酸顯著降低(P<0.05)。⑥與WKY組比較，SHR組IL-6和TNF-α均顯著增加(P<0.05)；阿托伐他汀可明顯降低I

14、L-6和TNF-α(P<0.05)。⑦硝基酪氨酸是氧化應(yīng)激的標(biāo)志物，與WKY組相比，SHR組硝基酪氨酸表達(dá)明顯增加(P<0.05)；阿托伐他汀可明顯降低硝基酪氨酸表達(dá)(P<0.05)。⑧與同周齡WKY對照組相比，SHR8、16、24周齡組大鼠主動(dòng)脈組織中p-PKD744/748、p-PKD916表達(dá)明顯升高(P<0.05)；隨著周齡的增加SHR組p-PKD744/748、p-PKD916表達(dá)水平逐漸升高(P<0.05)。同期WKY各組大

15、鼠的p-PKD744/748、p-PKD916沒有顯著性變化。SHR阿托伐他汀組p-PKD744/748、p-PKD916較SHR安慰劑組的表達(dá)減弱，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。SHR各組總的PKD表達(dá)無明顯變化。
　　 結(jié)論：⑴SHR大鼠隨著喂養(yǎng)時(shí)間延長呈增齡性主動(dòng)脈重塑，為高血壓主動(dòng)脈重塑發(fā)病機(jī)制的研究提供了可靠的動(dòng)物模型平臺(tái)。⑵SHR大鼠主動(dòng)脈組織中磷酸化PKD的表達(dá)隨著主動(dòng)脈重塑過程逐漸升高，提示磷酸化PKD參與了自發(fā)