周期蛋白D1在煙霧暴露大鼠肺血管重構(gòu)中的作用及其與蛋白激酶C的關(guān)系.pdf

1、吸煙是導(dǎo)致我國慢性阻塞性肺疾病的主要因素之一，并可能進而引起繼發(fā)性肺動脈高壓及慢性肺源性心臟病。肺血管重構(gòu)是引起繼發(fā)性肺動脈高壓并進一步導(dǎo)致慢性肺源性心臟病的最重要的機制之一。最近幾年的多項研究資料表明，吸煙可以不依賴于缺氧、肺功能改變以及血管床的損毀等過程而直接作用于肺血管，引起肺血管重構(gòu)并參與肺動脈高壓的形成。但是，其具體的分子機制目前并未完全清楚。
　　 蛋白激酶C（PKC）屬于絲氨酸-蘇氨酸激酶家族，它參與調(diào)控了體內(nèi)的多

2、種細胞的增殖、分化、凋亡、遷移和粘附等各種生物學(xué)的過程。我們實驗室通過最近幾年的研究后發(fā)現(xiàn)，香煙煙霧可以引起蛋白激酶Cα（PKCα）的表達上調(diào)和功能活化，而活化的PKC α再通過其下游的一系列信號傳導(dǎo)途徑促使肺動脈平滑肌細胞的異常增殖，這可能是吸煙直接參與肺血管重構(gòu)形成的重要機制之一。但是，關(guān)于PKCα下游尤其是細胞核內(nèi)的具體分子機制，目前知之甚少。
　　 以往的許多研究資料表明，PKC可以通過影響細胞周期蛋白來參與調(diào)控細胞的增

3、殖或凋亡過程。在細胞周期過程中，cyclinD1是調(diào)控細胞周期中G1/S期轉(zhuǎn)換的最重要的周期蛋白之一，其與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。而最近幾年的研究卻發(fā)現(xiàn)，cyclinD1參與了體內(nèi)的多種其他生理或病理過程，如妊娠晚期胎盤的血管生成、肝臟的再生以及心室的重構(gòu)等。但是，由于細胞和組織類型的不同，以及各種刺激因素的不同，有可能導(dǎo)致cyclinD1對各種細胞增殖或凋亡的調(diào)控作用有所不同，甚至有可能是相反。目前，關(guān)于cyclinD1是否參與了

4、吸煙導(dǎo)致的肺血管重構(gòu)過程以及在此過程中的具體作用，仍不十分清楚。
　　 雖然PKC可以通過對cyclinD1表達的調(diào)控來參與細胞的增殖或凋亡過程，但是在不同的細胞和組織中，PKC有可能對cyclinD1的表達有著完全不同的調(diào)控作用。比如，在各種上皮細胞和平滑肌細胞中，PKC對cyclinD1的影響可以是促進其轉(zhuǎn)錄和表達，也可以是抑制其轉(zhuǎn)錄和表達，這也決定了PKC在各種細胞的增殖或凋亡過程的作用不盡相同。目前，在肺血管中PKC對c

5、yclinD1的表達是否具有調(diào)控作用以及具有何種調(diào)控作用，也未見國內(nèi)外相關(guān)研究。
　　 基于以上的研究現(xiàn)狀，本課題主要通過對香煙煙霧暴露大鼠的觀察和干預(yù)，以及對大鼠肺動脈平滑肌細胞的體外培養(yǎng)和干預(yù)，以期探討cyclin D1在吸煙導(dǎo)致肺血管重構(gòu)過程中的具體作用及其與PKCα信號通路的關(guān)系。
　　
　　 研究內(nèi)容
　　 1.將清潔級的健康Wistar大鼠暴露于空氣或香煙煙霧中各3個月。通過外周肺組織的HE

6、染色和α-actin染色切片觀察肺血管重構(gòu)的程度，通過RT-PCR的方法以及Western Blot的方法檢測cyclinD1和PKCα的Mrna及蛋白表達水平。此部分試驗可以明確香煙煙霧暴露對cyclinD1表達的影響，以及cyclinD1與PKCα的相關(guān)關(guān)系。
　　 2.體外培養(yǎng)Wistar大鼠的肺動脈平滑肌細胞（大鼠PASMCs）。同時設(shè)計并合成針對大鼠cyclinD1基因的小干擾RNA（siRNA）。將大鼠PASMCs分

7、為四組：對照組（control），香煙煙霧提取物組（CSE），CSE+cyclinD1siRNA組（CD1-siRNA），CSE+陰性對照siRNA組（NC-siRNA）。干預(yù)24小時后，用細胞計數(shù)法和BrdU摻入率檢測細胞增殖，用流式細胞術(shù)分析細胞周期，用RT-PCR的方法和Western Blot的方法檢測cyclinD1的Mrna和蛋白的表達。此部分試驗可以明確cyclinD1在CSE刺激的大鼠PASMCs體外異常增殖過程中的具體

8、調(diào)控作用。
　　 3.體外培養(yǎng)Wistar大鼠的肺動脈平滑肌細胞（大鼠PASMCs）。設(shè)計并合成針對大鼠PKCα基因的小干擾RNA（siRNA）。將大鼠PASMCs分為四組：對照組（control），香煙煙霧提取物組（CSE），CSE+PKCα-siRNA組（PKCα-siRNA），CSE+陰性對照siRNA組（NC-siRNA）。干預(yù)24小時后，用細胞計數(shù)法和BrdU摻入率檢測細胞增殖，用流式細胞術(shù)分析細胞周期，用RT-PCR

9、的方法和Western Blot的方法檢測PKCα和cyclinD1的Mrna和蛋白的表達。此部分試驗可以明確PKCα是否調(diào)控了cyclinD1的表達，并進而參與CSE刺激大鼠PASMCs體外異常增殖的過程。
　　 4.將清潔級的健康Wistar大鼠暴露于空氣或香煙煙霧中，制作香煙煙霧暴露模型。構(gòu)建針對大鼠cyclinD1基因的shRNA質(zhì)粒和陰性對照質(zhì)粒，并分別在每周香煙煙霧暴露之前通過尾靜脈注射到大鼠體內(nèi)。三個月后處死大鼠，

10、通過外周肺組織的HE染色和α-actin染色切片觀察肺血管重構(gòu)，通過RT-PCR的方法以及Western Blot的方法檢測cyclinD1的Mrna及蛋白表達水平。此部分試驗可以明確在動物體內(nèi)cyclinD1是否參與了香煙煙霧暴露大鼠的肺血管重構(gòu)。
　　
　　 研究結(jié)果
　　 1.長期的香煙煙霧暴露可以引起大鼠的肺小血管重構(gòu)，同時伴隨有肺小血管中cyclinD1的Mrna和蛋白水平的顯著升高。CyclinD1

11、的蛋白水平與肺小血管的管壁厚度和PKCα蛋白水平呈明顯的正相關(guān)。
　　 2.香煙煙霧提取物（CSE）對大鼠PASMCs的體外增殖呈現(xiàn)雙向作用，即低濃度（1％，2％，5％）的CSE可以促進大鼠PASMCs的體外異常增殖，而高濃度（20％）的CSE則明顯抑制了大鼠PASMCs的體外異常增殖。采用針對大鼠cyclinD1基因的特異性siRNA可以顯著抑制大鼠PASMCs中cyclinD1的Mrna和蛋白質(zhì)水平。同時，該siRNA還可以

12、引起細胞的G1期阻滯，明顯抑制CSE所引起的細胞增殖。
　　 3.CSE可以引起大鼠PASMCs中PKCα和cyclinD1的Mrna和蛋白水平顯著升高，同時導(dǎo)致細胞的異常增殖。而PKCα的特異性siRNA不僅可以明顯抑制大鼠PASMCs中PKCα的Mrna和蛋白水平，而且可以顯著下調(diào)cyclinD1的Mrna和蛋白水平。另外，該siRNA還可以引起大鼠PASMCs的G1期阻滯，明顯抑制CSE所引起的細胞增殖。
　　 4

13、.針對大鼠cyclinD1基因的shRNA表達質(zhì)粒可以通過尾靜脈注射的方法成功的轉(zhuǎn)染到大鼠的肺血管中。該shRNA可以在體內(nèi)下調(diào)肺血管中的cyclinD1的Mrna和蛋白水平，同時還可以減輕香煙煙霧暴露所引起的肺小血管肌化程度和小血管壁的厚度。
　　
　　 結(jié)論
　　 1.香煙煙霧暴露后大鼠肺小血管中cyclinD1明顯升高，并與肺小血管的重構(gòu)程度和PKCα蛋白水平呈正相關(guān)。CyclinD1有可能參與了香煙煙霧

14、暴露大鼠的肺血管重構(gòu)過程。
　　 2.CyclinD1的特異性siRNA可以成功地抑制大鼠PASMCs的體外異常增殖，cyclinD1在CSE致大鼠PASMCs體外異常增殖過程中發(fā)揮了正向調(diào)控作用。
　　 3.PKCα可以上調(diào)大鼠PASMCs中的cyclinD1表達，并通過此途徑來參與調(diào)控CSE刺激下的大鼠PASMCs體外異常增殖過程。
　　 4.CyclinD1的shRNA質(zhì)?？捎行У販p輕香煙煙霧暴露后大鼠的肺

15、血管重構(gòu)程度。CyclinD1參與了吸煙直接導(dǎo)致大鼠肺血管重構(gòu)的發(fā)病過程。
　　
　　 綜上所述，我們認為cyclinD1在吸煙致肺血管重構(gòu)的過程中發(fā)揮了重要的正向調(diào)節(jié)作用，而PKCα可以通過調(diào)控cyclinD1的表達來參與此過程。本課題從細胞周期調(diào)控和細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的角度補充了吸煙導(dǎo)致肺血管重構(gòu)的具體分子機制，有可能為將來肺動脈高壓的治療提供一點新的思路。當然，有關(guān)cyclinD1和PKCα的具體分子調(diào)控機制，還需