結(jié)締組織生長(zhǎng)因子與細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶及蛋白激酶C信號(hào)通路在香煙煙霧致肺血管重構(gòu)調(diào)控機(jī)制中的作用及關(guān)系.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開(kāi)論述：
　　第一部分 結(jié)締組織生長(zhǎng)因子和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2、蛋白激酶Cα在香煙煙霧暴露大鼠肺血管重構(gòu)中的表達(dá)變化
　　目的：探討在香煙煙霧暴露大鼠的肺血管中結(jié)締組織生長(zhǎng)因子、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2和蛋白激酶Cα表達(dá)的變化，以及它們與香煙煙霧暴露大鼠肺血管重構(gòu)的關(guān)系。
　　方法：將24只健康雄性Wistar大鼠（8周齡）隨機(jī)平均分為4組：C組（對(duì)照組），S-1M組（香煙煙霧暴露1月組），

2、S-3M組（香煙煙霧暴露3月組）和S-6M組（香煙煙霧暴露6月組）。取動(dòng)脈血檢測(cè)血氧分壓（PaO2），HE和平滑肌細(xì)胞α肌動(dòng)蛋白染色觀察肺血管重構(gòu)情況，Western blotting檢測(cè)大鼠肺動(dòng)脈平滑肌中 CTGF、PKCα和p-ERK1/2蛋白的表達(dá)量。
　　結(jié)果：各組大鼠動(dòng)脈血氧分壓之間比較無(wú)顯著性差異，隨著香煙煙霧暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，肺血管壁厚度和血管直徑的比值（％WT）、完全肌化血管比例、CTGF和p-ERK1/2、PKCα

3、的蛋白表達(dá)水平隨香煙煙霧暴露時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，各組間比較有顯著性差異（p﹤0.05）。CTGF和p-ERK1/2、PKCα的蛋白表達(dá)與大鼠的肺血管％WT和完全肌化血管比例呈正相關(guān)。
　　結(jié)論：香煙煙霧暴露大鼠的肺血管重塑隨暴露時(shí)間的延長(zhǎng)而加重。同時(shí)，CTGF、活化的ERK1/2和PKCα在血管平滑肌中的表達(dá)隨暴露時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著增加，CTGF、ERK1/2的活化和PKCα可能與香煙煙霧暴露致大鼠肺血管重構(gòu)有關(guān)。
　　第二部分

4、 結(jié)締組織生長(zhǎng)因子和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2、蛋白激酶Cα信號(hào)通路在香煙煙霧提取物致大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖中的作用及其之間的關(guān)系
　　目的：探討結(jié)締組織生長(zhǎng)因子在香煙煙霧提取物致大鼠肺動(dòng)脈平滑肌增殖過(guò)程中是否通過(guò)蛋白激酶Cα、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)。
　　方法：大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，應(yīng)用不同濃度（5、10、20、40、80μg/ml）的香煙煙霧提取物（CSE）刺激24小時(shí)，通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)評(píng)價(jià)細(xì)胞

5、增殖情況。1、將細(xì)胞分成5組：正常對(duì)照組（CM組），CSE組，NsiRNA組，CSE+NsiRNA組，CSE+CTGFsiRNA組，各組細(xì)胞同步化后用相應(yīng)的siRNA轉(zhuǎn)染，再給予CSE刺激；2、將細(xì)胞分成4組：正常對(duì)照組（CM組），CSE組，PD98059組，CSE+PD98059組，各組細(xì)胞同步化后需要的應(yīng)用PD98059預(yù)處理1小時(shí)，之后應(yīng)用CSE刺激。采用細(xì)胞計(jì)數(shù)及BrdU摻入法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，分別采用real-time PCR

6、和Western blotting檢測(cè)各組CTGF、ERK1/2和PKCα的mRNA及蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：20μg/ml的CSE濃度對(duì)細(xì)胞的促增殖作用最強(qiáng)，在CSE（20μg/ml）刺激下，CTGF和PKCα的mRNA和蛋白表達(dá)水平均升高，大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖明顯；CTGFsiRNA除了明顯抑制CTGF的表達(dá)之外，PKCα的mRNA和蛋白表達(dá)和ERK1/2的活化也明顯受到抑制，CSE誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖也受到抑制；P

7、D98059可以抑制CSE刺激下ERK1/2的磷酸化及肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖，但是對(duì)CTGF mRNA和蛋白的表達(dá)沒(méi)有顯著影響。
　　結(jié)論：結(jié)締組織生長(zhǎng)因子在香煙煙霧提取物刺激誘導(dǎo)的大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞異常增長(zhǎng)的過(guò)程中，通過(guò)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2和蛋白激酶Cα信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)。
　　第三部分 結(jié)締組織生長(zhǎng)因子和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2、蛋白激酶Cα信號(hào)通路在香煙煙霧致大鼠肺血管重構(gòu)中的作用及關(guān)系
　　目的：探討結(jié)締組

8、織生長(zhǎng)因子在香煙煙霧暴露致大鼠肺血管重構(gòu)中是否通過(guò)蛋白激酶Cα、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)。
　　方法：構(gòu)建沉默大鼠CTGF表達(dá)的慢病毒，1、轉(zhuǎn)染大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，將細(xì)胞分成5組：正常對(duì)照組（CM組），CSE組，LV-NsiRNA組，CSE+LV-NsiRNA組，CSE+LV-CTGFsiRNA組，各組細(xì)胞同步化后用轉(zhuǎn)染相應(yīng)的siRNA慢病毒載體，再給予CSE刺激；2、通過(guò)氣道給藥的方式用慢病毒感染大鼠，將大鼠分

9、成4組：正常對(duì)照組（controls組），煙霧暴露組（smoking組），煙霧暴露陰性病毒干預(yù)組（smoking+LV-NsiRNA組），煙霧暴露陽(yáng)性病毒干預(yù)組（smoking+LV-CTGFsiRNA組），每組6只，各組大鼠根據(jù)不同情況進(jìn)行煙霧暴露和/或病毒感染，煙霧暴露時(shí)間為6周，分別應(yīng)用real-time PCR和Western blotting檢測(cè)各組大鼠肺血管CTGF、ERK1/2和PKCα的mRNA及蛋白表達(dá)，通過(guò)HE染色和

10、平滑肌細(xì)胞α肌動(dòng)蛋白染色觀察肺血管重構(gòu)情況。
　　結(jié)果：慢病毒成功轉(zhuǎn)染大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，沉默CTGF表達(dá)的陽(yáng)性慢病毒可以使CSE（20μg/ml）刺激下高表達(dá)的CTGF明顯受到抑制，大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖也顯著受到抑制，慢病毒構(gòu)建成功；各組大鼠在不同慢病毒感染和/或香煙煙霧暴露處理完成后處死，各組PaO2無(wú)顯著差異，和對(duì)照組比較，香煙煙霧暴露組CTGF和PKCα、p-ERK1/2表達(dá)升高，和香煙煙霧暴露陰性病毒感染組比較，香