結(jié)締組織生長(zhǎng)因子在香煙煙霧暴露大鼠肺血管重構(gòu)中的作用及其與周期蛋白D1的關(guān)系.pdf

1、第一部分結(jié)締組織生長(zhǎng)因子和周期蛋白D1在香煙煙霧暴露大鼠肺血管重構(gòu)中的表達(dá)變化
　　 目的：探討煙霧暴露致大鼠肺血管重構(gòu)中結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)和周期蛋白D1（cyclinD1）的表達(dá)變化及意義。
　　 方法：健康雄性SD大鼠24只，隨機(jī)分為對(duì)照組，煙霧暴露2周、煙霧4周和煙霧暴露8周組，取動(dòng)脈血檢測(cè)血氧分壓(PaO2)，HE染色和平滑肌細(xì)胞α肌動(dòng)蛋白(α-SM-actin)染色觀察肺血管重構(gòu)，免疫組化觀察CTGF

2、和cyclinD1在肺動(dòng)脈平滑肌中的表達(dá)，實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)肺動(dòng)脈CTGFmRNA和cyclinD1mRNA表達(dá)，Western Blotting檢測(cè)CTGF和cyclinD1蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果：各組大鼠動(dòng)脈血氧分壓均無(wú)顯著性差異。隨煙霧暴露時(shí)間延長(zhǎng)，肌化血管比例、肺血管壁厚度和血管直徑比值（％WT）、CTGF和cyclinD1的mRNA和蛋白表達(dá)均呈時(shí)間依賴性增加，各組間比較均有顯著差異。C

3、TGF與 cyclinD1表達(dá)與肺血管壁厚度和血管直徑比值（％WT）顯著正相關(guān)，二者的表達(dá)之間也呈顯著正相關(guān)關(guān)系。
　　 結(jié)論：煙霧暴露大鼠中，CTGF和cyclinD1表達(dá)均隨暴露時(shí)間（2w~8w）延長(zhǎng)而顯著上調(diào)，二者可能與煙霧暴露致肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞異常增殖有關(guān)。
　　 第二部分結(jié)締組織生長(zhǎng)因子在香煙煙霧提取物導(dǎo)致的大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖中的作用及其和周期蛋白D1的關(guān)系
　　 目的：香煙煙霧可以誘導(dǎo)肺血管重構(gòu)

4、的發(fā)生，肺血管重構(gòu)的特點(diǎn)是肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的異常增殖導(dǎo)致的肺動(dòng)脈中膜增厚。但是，該病理過程的具體機(jī)制不明。本研究的目的是探討結(jié)締組織生長(zhǎng)因子是否通過上調(diào)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的周期蛋白D1的表達(dá)進(jìn)而調(diào)節(jié)香煙煙霧提取物誘導(dǎo)的大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖。
　　 方法：原代培養(yǎng)大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，使用不同的CSE濃度（1％，2％，5％，10％）進(jìn)行孵育，24小時(shí)后使用細(xì)胞計(jì)數(shù)方法檢測(cè)不同CSE濃度對(duì)細(xì)胞增殖的影響。根據(jù)結(jié)果，2％CSE對(duì)細(xì)

5、胞的增殖促進(jìn)作用最強(qiáng)。將細(xì)胞分為5組，正常對(duì)照組，2％CSE組，2％CSE+CTGFsiRNA組，2％CSE+NCsiRNA組，2％CSE+cyclinD1siRNA組，各組同步化后轉(zhuǎn)染相關(guān)的siRNA，再給予2％CSE孵育。使用細(xì)胞計(jì)數(shù)法和 BrdU檢測(cè)評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖情況。定量PCR檢測(cè)結(jié)締組織生長(zhǎng)因子和周期蛋白D1的mRNA表達(dá)水平，western blotting和免疫熒光染色檢測(cè)結(jié)締組織生長(zhǎng)因子和周期蛋白D1的蛋白表的水平。流式細(xì)

6、胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期的分布。
　　 結(jié)果：在2％CSE的刺激下，大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的結(jié)締組織生長(zhǎng)因子mRNA水平和蛋白水平均升高，并促進(jìn)細(xì)胞增殖。CTGFsiRNA抑制CSE誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖。此外，CTGFsiRNA明顯抑制cyclinD1的mRNA水平和蛋白水平，并導(dǎo)致細(xì)胞周期G1期停滯，進(jìn)而減少大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖。
　　 結(jié)論：上述結(jié)果表明，結(jié)締組織生長(zhǎng)因子促進(jìn)香煙煙霧提取物誘導(dǎo)的大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖，部分原

7、因是其上調(diào)周期蛋白D1的表達(dá)。
　　 第三部分結(jié)締組織生長(zhǎng)因子在香煙煙霧暴露大鼠肺血管重構(gòu)中的作用及其和周期蛋白D1的關(guān)系
　　 目的：香煙煙霧通過誘導(dǎo)肺血管重構(gòu)導(dǎo)致肺動(dòng)脈高壓，肺血管重構(gòu)涉及肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖。結(jié)締組織生長(zhǎng)因子是一種富含半胱氨酸的肽，參與多重生物過程，入細(xì)胞增殖，細(xì)胞遷移。本研究目的是探討結(jié)締組織生長(zhǎng)因子在肺血管重構(gòu)中的潛在作用。
　　 方法：構(gòu)建表達(dá)shRNA的干擾質(zhì)粒，降低原代培養(yǎng)的大鼠肺

8、動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞和大鼠肺動(dòng)脈中的結(jié)締組織生長(zhǎng)因子表達(dá)。將大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞使用香煙煙霧提取物孵育，大鼠分為4組，正常對(duì)照組，煙霧暴露組，煙霧暴露加CTGFshRNA干預(yù)組，煙霧暴露加陰性對(duì)照shRNA干預(yù)組，每組6只。煙霧暴露時(shí)間為3個(gè)月。通過尾靜脈注射給予質(zhì)粒。
　　 結(jié)果：CTGFshRNA抑制香煙煙霧誘導(dǎo)的大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中的結(jié)締組織生長(zhǎng)因子和周期蛋白D1表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞周期G1期停滯，抑制細(xì)胞增殖。尾靜脈注射CTGF干