整合素α-,5-β-,1-，細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶和蛋白激酶C在纖維粘連蛋白碎片誘導(dǎo)髓核細(xì)胞退變過程中的作用.pdf

1、間盤退變是一個(gè)復(fù)雜的過程，多種因素參與了間盤退變的過程。纖維粘連蛋白是一種存在于間盤細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)的糖蛋白，其可以被基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)分解為纖維粘連蛋白碎片(Fn—f)。研究表明，F(xiàn)n—f在退變間盤的含量明顯增加，且Fn—f有誘導(dǎo)間盤退變的作用。如果將Fn—f注入正常的間盤內(nèi)，間盤出現(xiàn)退變樣改變，而如果將Fn—f加入髓核細(xì)胞的培養(yǎng)液中，髓核細(xì)胞同樣發(fā)生退變。而且已證明纖維粘連蛋白和Fn—f在細(xì)胞膜上主要的受體是整合素α5β1。但是目

2、前對(duì)于Fn—f誘導(dǎo)髓核細(xì)胞退變的具體機(jī)制并不清楚。 整合素是一組細(xì)胞表面的黏附分子，是多種基質(zhì)蛋白的膜受體，其可以參與細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)，調(diào)控基因表達(dá)、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡。研究表明整合素α1，α5，αv，β1，β3在正常人間盤組織內(nèi)表達(dá)，這些整合素亞基在間盤內(nèi)可以起到力學(xué)傳導(dǎo)器和基質(zhì)蛋白受體等作用。整合素有力學(xué)傳感器的作用，其可以在細(xì)胞把力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)化為化學(xué)信號(hào)的過程中發(fā)揮作用。且整合素可以與間盤內(nèi)多種基質(zhì)蛋白相互作用，如α1β1亞單

3、位是膠原蛋白在間盤細(xì)胞膜上的主要受體，而α5β1亞單位是纖維結(jié)合蛋白的膜受體。然而目前并不清楚整合素在退變間盤內(nèi)的表達(dá)情況，而且同樣不清楚整合素α5β1在Fn—f誘導(dǎo)髓核細(xì)胞退變的過程中起到何種作用。 細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1和2(ERK1/2)和蛋白激酶C(PKC)是兩種重要的信號(hào)傳導(dǎo)蛋白。已有研究表明ERK和PKC在間盤的退變過程中發(fā)揮作用，而且ERK和PKC在Fn—f誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞退變的過程起到了信號(hào)傳導(dǎo)的作用。那么ERK和PK

4、C在Fn—f誘導(dǎo)髓核細(xì)胞退變的過程是否發(fā)揮同樣的作用？ 目的： 檢測(cè)整合素α1，α5，αv，β1，β3在退變的人間盤內(nèi)的表達(dá)情況。探討Fn—f加入髓核細(xì)胞培養(yǎng)液中后，整合素α5β1的表達(dá)情況和ERK1/2的活化情況。研究整合素α5β1，ERK1/2和PKC在Fn—f誘導(dǎo)髓核細(xì)胞退變的過程中起到的作用。 方法： 術(shù)中收集人間盤髓核標(biāo)本40例，分為三組：正常組(n=10)，突出組(n=15)，脫出組(n=15

5、)。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)和免疫沉淀技術(shù)比較整合素α1，α5，αv，β1，β3在以上三組內(nèi)的表達(dá)情況，同時(shí)比較了整合素的配體—膠原蛋白(Ⅰ和Ⅱ型)和纖維粘連蛋白的表達(dá)情況。 體外分離和培養(yǎng)兔間盤髓核細(xì)胞，在培養(yǎng)液中加入110 kDa纖維粘連蛋白碎片。通過免疫印跡技術(shù)、免疫熒光技術(shù)及RT-PCR的方法，檢測(cè)整合素α5β1亞基、Ⅱ型膠原蛋白、MMP9和MMP13的表達(dá)情況。通過免疫印跡技術(shù)檢測(cè)ERK1/2的磷酸化情

6、況。然后特異性抑制整合素α5β1的表達(dá)，觀察Fn—f對(duì)髓核細(xì)胞有何影響。利用ERK1/2磷酸化的特異性抑制劑和PKC活化的特異性抑制劑來研究ERK1/2和PKC的作用。 結(jié)果： 1、整合素在人髓核組織中的表達(dá)情況 整合素α1，α5，αv，β1，β3在三組間盤都有表達(dá)。整合素α5在脫出組和突出組的表達(dá)分別是正常組的2.2倍和1.5倍。整合素β1在脫出組和突出組的含量分別是正常組的2.5倍和1.6倍。而纖維粘連蛋白在

7、退變髓核內(nèi)的表達(dá)同樣有升高的趨勢(shì)。但整合素α1，αv，β3在三組內(nèi)的表達(dá)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 2、Fn—f對(duì)于髓核細(xì)胞的影響 加入Fn—f后，髓核細(xì)胞的整合素α5和β1亞基表達(dá)明顯增加，而Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)下降，MMP9和MMP13的表達(dá)增加，同時(shí)ERK1/2的磷酸化也明顯增強(qiáng)。 3、整合素α5β1在Fn—f誘導(dǎo)髓核細(xì)胞過程中的作用 特異性抑制整合素α5β1表達(dá)后，F(xiàn)n—f不能誘導(dǎo)髓核細(xì)胞退變，Ⅱ型膠原蛋白、M

8、MP9和MMP13的表達(dá)沒有變化，ERK1/2的磷酸化也并沒有被增強(qiáng)。 4、ERK1/2和PKC的作用 ERK1/2磷酸化的特異性抑制劑PD98059和PKC活化的特異性抑制劑GF109203X加入髓核細(xì)胞的培養(yǎng)基中后，F(xiàn)n—f誘導(dǎo)髓核細(xì)胞退變的作用同樣被抑制。 討論： 已有研究表明隨著間盤由突出向脫出的發(fā)展，間盤退變的程度也越來越嚴(yán)重。即隨著間盤退變進(jìn)程的發(fā)展，整合素α5和β1亞基在髓核內(nèi)的表達(dá)也隨之

9、增加。實(shí)驗(yàn)中有意義的是纖維粘連蛋白和其受體α5和β1亞基有同樣的增加趨勢(shì)。并在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中證明了Fn—f可以增加其受體α5和β1亞基的表達(dá)。當(dāng)然仍有很多其它因素可以影響整合素表達(dá)。缺氧環(huán)境就是整合素表達(dá)變化的重要原因之一，Risbud等發(fā)現(xiàn)在缺氧的環(huán)境下培養(yǎng)髓核細(xì)胞，可以增強(qiáng)細(xì)胞MAPK的活性，增加整合素亞基的表達(dá)。同樣壓力也可以影響整合素的表達(dá)，當(dāng)間盤細(xì)胞在體外加壓培養(yǎng)后，某些整合素亞基的表達(dá)出現(xiàn)下降趨勢(shì)。當(dāng)然以上這些實(shí)驗(yàn)都是在體外

10、細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境下進(jìn)行的，由于體內(nèi)環(huán)境與體外細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境有很大區(qū)別，體內(nèi)多種因素共同作用于間盤造成其退變的結(jié)局，因此退變間盤內(nèi)整合素表達(dá)的變化可能是這些因素共同作用的結(jié)果。 Fn—f是間盤退變過程中纖維粘連蛋白的分解產(chǎn)物，其含量在退變間盤內(nèi)的含量明顯增加。究其原因有兩方面，一方面是纖維粘連蛋白在退變間盤內(nèi)的表達(dá)增多，另一方面在退變過程中MMP的表達(dá)明顯增加，而正是MMP將纖維粘連蛋白分解為Fn—f。而在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)都證明了

11、Fn—f有減少糖蛋白表達(dá)，促進(jìn)基質(zhì)蛋白分解的作用。本實(shí)驗(yàn)中同樣證明了這個(gè)結(jié)論，F(xiàn)n—f減少了Ⅱ型膠原蛋白的表達(dá)，增加了MMP9和MMP13的表達(dá)。研究Fn—f的退變機(jī)制時(shí)，Homandberg提出Fn—f的作用由Fn—f、MMP、纖維粘連蛋白、Ⅱ型膠原蛋白組成的正反饋惡性循環(huán)，即Fn—f增加了MMP的表達(dá)，增加的MMP分解纖維粘連蛋白形成更多的Fn—f，而Ⅱ型膠原蛋白的表達(dá)減少是這個(gè)惡性循環(huán)的最終結(jié)局。而本實(shí)驗(yàn)觀察到的Fn—f減少Ⅱ型膠

12、原蛋白的表達(dá)，增加MMP9和MMP13的表達(dá)正與這個(gè)理論一致。那么整合素α5β1在這個(gè)惡性循環(huán)中處于什么位置呢。在本研究中同樣發(fā)現(xiàn)Fn—f有促進(jìn)整合素α5、β1亞基表達(dá)作用。由于整合素β5β1在Fn—f誘導(dǎo)間盤退變過程中起到了膜受體的作用，而Fn—f又有促進(jìn)其受體表達(dá)增加的作用，那么Fn—f對(duì)于間盤作用的惡性循環(huán)可以做進(jìn)一步的探討?？梢詫⒄纤卅?β1納入這個(gè)正反饋惡性循環(huán)，即Fn—f與髓核細(xì)胞膜上的整合素α5β1結(jié)合后，影響了髓核細(xì)胞

13、的代謝，MMP和受體整合素α5β1的表達(dá)都增加，MMP分解纖維粘連蛋白使Fn—f的量增加，而整合素α5β1表達(dá)的增加使Fn—f的結(jié)合位點(diǎn)增多，促進(jìn)了Fn—f誘導(dǎo)髓核細(xì)胞退變的作用。因此，整合素α5β1既是Fn—f在間盤細(xì)胞上的受體，同時(shí)又是Fn—f誘導(dǎo)間盤退變的正反饋惡性循環(huán)中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。 ERK1/2和PKC同樣參與了Fn—f誘導(dǎo)髓核細(xì)胞退變的過程，ERK1/2的磷酸化在Fn—f的作用下明顯增強(qiáng)。而且ERK1/2磷酸化的特異

14、性抑制劑PD98059和PKC活化的特異性抑制劑GF109203X抑制了Fn—f誘導(dǎo)髓核細(xì)胞退變的作用。因此，可以認(rèn)為ERK1/2和PKC同樣是Fn—f誘導(dǎo)間盤退變的正反饋惡性循環(huán)中的環(huán)節(jié)，即Fn—f與髓核細(xì)胞膜上的整合素α5β1結(jié)合后，激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)蛋白PKC，增強(qiáng)了ERK1/2的磷酸化，引起蛋白表達(dá)變化，增加了整合素α5β1和MMP的表達(dá)，減低了Ⅱ型膠原蛋白的表達(dá)，增加的MMP又進(jìn)一步分解纖維粘連蛋白為Fn—f。 結(jié)論：