白蛋白對(duì)大鼠腎臟功能及整合素連接激酶、整合素β1和α-輔肌動(dòng)蛋白-4的影響.pdf

1、研究背景:
　　 腎臟是人體的重要器官，主要參與機(jī)體的排泄以及維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。慢性腎病已經(jīng)成為當(dāng)今社會(huì)嚴(yán)重危害人類健康的疾病之一。蛋白尿是慢性腎病進(jìn)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，病人一旦出現(xiàn)持續(xù)性蛋白尿則病情不可逆轉(zhuǎn)而發(fā)展至終末期腎功能衰竭。腎小球是腎臟發(fā)揮濾過和排泄功能的主要部位，在某些病理因素的作用下，腎小球的濾過屏障極易受損，導(dǎo)致大分子蛋白質(zhì)隨尿液滲出而形成蛋白尿。腎小球的濾過屏障由毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、基底膜以及足細(xì)胞構(gòu)成，足細(xì)胞在腎

2、小球?yàn)V過過程中發(fā)揮了最關(guān)鍵的作用。腎小球疾病主要的病理學(xué)改變?yōu)槟I小球?yàn)V過屏障受損而導(dǎo)致的蛋白尿。研究認(rèn)為尿蛋白對(duì)近端腎小管上皮細(xì)胞有直接損害作用，蛋白尿可以通過損傷腎小管來加重腎臟損害和促進(jìn)慢性腎病的進(jìn)展。以往的研究表明，足細(xì)胞數(shù)目及其密度與尿蛋白量呈顯著負(fù)相關(guān)，腎病患者臨床表現(xiàn)為蛋白尿時(shí)均伴有足細(xì)胞數(shù)目及密度的減少，其中以大量蛋白尿最為顯著，但其機(jī)制尚未清楚。
　　 Integrinα3β1是足細(xì)胞貼近GBM側(cè)的跨膜蛋白，在維

3、持足細(xì)胞與GBM之間的粘附和足細(xì)胞內(nèi)外跨膜信號(hào)傳導(dǎo)方面發(fā)揮了重要作用。Integrinα3β1不僅可以通過與GBM上的配體直接結(jié)合，將足細(xì)胞牢牢地錨定在基底膜上;還可以通過與細(xì)胞骨架直接連接維持足突的形態(tài)，調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的動(dòng)力學(xué)。一方面，ILK通過C端與integrinβ1相連，直接參與和調(diào)節(jié)整合素通路的相關(guān)過程;另一方面，ILK還可以通過N端與α-actinin-4及細(xì)胞骨架相連，參與整合素和α-actinin-4介導(dǎo)的細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)過

4、程。α-Actinin-4是足細(xì)胞上特異表達(dá)的細(xì)胞骨架輔肌動(dòng)蛋白，能夠與F-actin直接連接，在維持足突結(jié)構(gòu)方面尤為重要。白蛋白是蛋白尿的主要成分，因此，本實(shí)驗(yàn)選取ILK、integrinβ1和α-actinin-4作為目的蛋白，研究白蛋白超負(fù)荷大鼠腎臟功能的改變及腎臟總ILK、integrinβ1和α-actinin-4的表達(dá)情況。此外，我們通過體外足細(xì)胞白蛋白超負(fù)荷模型觀測(cè)在大量白蛋白的刺激下足細(xì)胞中ILK、integrinβ1和

5、α-actinin-4的表達(dá)情況。為深入探討足細(xì)胞的損傷機(jī)制提供理論依據(jù)，對(duì)慢性腎病的早期防治具有重要意義。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:
　　 一、白蛋白對(duì)大鼠腎臟功能及ILK、integrinβ1和α-actinin-4的影響
　　 模型組大鼠每天每只腹腔注射2g白蛋白，對(duì)照組大鼠每天每只腹腔注射等體積生理鹽水。收集白蛋白注射后第1、3、7、13天的尿液，第14天處死大鼠，取腎臟和血液用于后續(xù)試驗(yàn)。
　　 1.白

6、蛋白對(duì)大鼠腎臟功能的影響。
　　 記錄大鼠體重和尿量，測(cè)定尿總蛋白和尿肌酐;取左腎組織進(jìn)行常規(guī)石蠟切片，HE染色，觀察腎臟組織形態(tài);透射電鏡觀察足細(xì)胞形態(tài);取血測(cè)定血肌酐、稱量右腎重量。
　　 2.白蛋白對(duì)大鼠腎臟總ILK、integrinβ1和α-actinin-4的影響
　　 采用westernblot和免疫組織化學(xué)染色法觀察白蛋白對(duì)大鼠腎總ILK、integrinβ1和α-actinin-4蛋白表達(dá)的影響;

7、采用RT-PCR法觀察白蛋白對(duì)大鼠腎總ILK、integrinβ1和α-actinin-4mRNA表達(dá)的影響。
　　 二、白蛋白對(duì)足細(xì)胞ILK、integrinβ1和α-actinin-4的影響
　　 實(shí)驗(yàn)前將分化成熟的足細(xì)胞(MP5)在1％FCS中過夜，以BSA的終濃度0、5、10、20mg/mL孵育12、24、48h。Westernblot和免疫熒光法檢測(cè)白蛋白對(duì)足細(xì)胞ILK、integrinβ1和α-actinin

8、-4蛋白表達(dá)的影響;實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)白蛋白對(duì)足細(xì)胞ILK、integrinβ1和α-actinin-4mRNA表達(dá)的影響。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 一、白蛋白對(duì)大鼠腎臟功能及ILK、integrinβ1和α-actinin-4的影響
　　 1.白蛋白對(duì)大鼠腎臟功能的影響。
　　 白蛋白注射第3天24h尿總蛋白急劇升高并達(dá)到最高峰，第7天至第13天均維持著較高的水平;白蛋白組尿量低于對(duì)照組且呈深黃色;H

9、E染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)白蛋白注射組腎小球內(nèi)有細(xì)胞融合發(fā)生，腎小管管腔上皮細(xì)胞破損;電鏡照片顯示白蛋白注射組足突發(fā)生明顯融合，有部分GBM裸露。
　　 2.白蛋白對(duì)大鼠腎臟總ILK、integrinβ1和α-actinin-4的影響
　　 Westernblot和免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明白蛋白組大鼠腎總ILK和α-actinin-4蛋白的表達(dá)水平高于對(duì)照組，而integrinβ1蛋白的表達(dá)水平低于對(duì)照組;RT-PCR結(jié)果表明白蛋白

10、組大鼠腎總ILK和α-actinin-4mRNA的表達(dá)水平高于對(duì)照組，而白蛋白組大鼠腎總integrinβ1mRNA的表達(dá)水平低于對(duì)照組。
　　 二、白蛋白對(duì)小鼠足細(xì)胞ILK、integrinβ1和α-actinin-4的影響
　　 足細(xì)胞與白蛋白作用一段時(shí)間后，ILK與α-actinin-4的蛋白水平和mRNA水平顯著升高，并且呈現(xiàn)一定的濃度依賴性和時(shí)間依賴性。Integrinβ1的蛋白表達(dá)呈一定濃度依賴性和時(shí)間依賴性