整合素連接激酶在胎盤血管性疾病中的作用研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 ILK在子癇前期發(fā)病機制中的作用
　　目的：
　　探討 ILK在子癇前期患者臍血 EPCs中的表達及其在新生血管形成中的作用。
　　方法：
　　1.分離、培養(yǎng)正常組和子癇前期組臍血 EPCs,利用細胞形態(tài)學和免疫熒光吞噬功能(FITC-UEA-I和DiI-ac-LDL)檢測鑒定;
　　2.采用逆轉錄聚合酶鏈反應檢測臍血 EPCs ILKmRNA的表達;<

2、br>　　3.采用免疫印跡技術檢測臍血 EPCs ILK蛋白的表達;
　　4.采用小管形成實驗檢測 EPCs血管形成能力。
　　結果：
　　1.分離培養(yǎng)單個核細胞,FITC-UEA-I和DiI-ac-LDL雙陽性細胞為正在分化的EPCs;
　　2.正常妊娠組 EPCs中ILKmRNA相對吸光度(A)值較子癇前期組顯著升高(0.64±0.05與0.45±0.06),子癇前期組輕度者較重度者顯著升高(0.47±0.0

3、7與0.39±0.08);
　　3.正常妊娠組 EPCs中ILK蛋白 A值較子癇前期組明顯升高(32±2與26±1),子癇前期組輕度者較重度者顯著升高(25±2與20±2);
　　4.正常妊娠組小管結構形成的數(shù)量較子癇前期組顯著增多(330±8與135±7),子癇前期組重度者的小管形成的數(shù)量明顯少于輕度者(148±6與116±8)。
　　結論：
　　子癇前期患者 EPCs中ILKmRNA及其蛋白表達下降可能與子癇

4、前期的發(fā)生密切相關。
　　第二部分 ILK對 EPCs與血管形成相關能力的作用
　　目的：
　　研究上調 ILK的表達對 EPCs細胞增殖、遷移和管腔形成能力的影響,了解 ILK在 EPCs形成血管過程中的作用。
　　方法：
　　1.分離、培養(yǎng)重度子癇前期患者臍血 EPCs,將細胞分為實驗組(轉染 Ad-GFP-ILK)、陰性對照組(轉染 Ad-GFP)和空白對照組(不進行細胞轉染)3組;
　　2.采

5、用實時熒光定量 PCR技術檢測 ILK mRNA的表達;
　　3.采用免疫印跡技術檢測 ILK蛋白的表達;
　　4.采用活細胞計數(shù)試劑盒(Cell Counting Kit-8,CCK-8)比色法測定轉染后細胞的增殖能力;
　　5.采用Transwell模型遷移實驗檢測轉染后細胞的遷移能力;
　　6.采用重懸貼壁法檢測轉染后細胞的分化能力；
　　7.采用小管形成實驗檢測轉染后細胞的的管腔形成能力。
　

6、　結果：
　　1.轉染后 EPCs中ILK mRNA和蛋白的表達水平,實驗組分別為0.831±0.14、0.78±0.12,分別與陰性對照組(分別為0.453±0.21、0.34±0.16)比較,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);空白對照組分別為(0.391±0.13、0.41±0.21),分別與陰性對照組相比,差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　2.轉染24小時后 EPCs的增殖能力,實驗組的積分吸光度(A)值為2

7、.343±0.027,與陰性對照組(1.625±0.033)相比,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);空白對照組為1.461±0.024,與陰性對照組相比,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　3.轉染24小時后遷移入小室下室的細胞數(shù)目,實驗組為(138.4±2.6)個,高于陰性對照組(82.6±3.7)個,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);空白對照組為(95.3±4.2)個,與陰性對照組相比,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。<

8、br>　　4.轉染24小時后,分化成梭形細胞的數(shù)目,實驗組為(546.1±6.3)個,陰性對照組為(323.2±3.3)個,空白對照組為(267.4±3.6)個。各組分別比較,實驗組與陰性對照組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);陰性對照組與空白對照組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　5.轉染24h后,各組 EPCs均未在 Matrigel上形成明顯的管腔網絡狀結構,但實驗組形成小管趨勢較對照組明顯。
　　結論：

9、　　ILK基因表達水平的升高可以影響 EPCs的增殖、遷移和小管形成能力。
　　第三部分 局部轉染 ILK改善 RUPP缺血模型大鼠胎盤灌注
　　目的：
　　通過腺病毒轉染技術局部轉染模型大鼠胎盤,觀察轉染 ILK基因后胎盤形態(tài)學和微血管密度等方面的變化,探討 ILK在改善孕鼠胎盤血管生長的可能作用和機制。
　　方法：
　　1.建立孕鼠RUPP缺血模型;
　　2.模型鼠分組,并采用體內腺病毒轉染技術將

10、過表達 ILK的載體轉染入孕鼠胎盤組織;
　　3.轉染后的孕鼠組織行冰凍切片,熒光顯微鏡下觀察 GFP表達以了解病毒的轉染效果;
　　4.測量孕17天大鼠轉染后胎盤的重量;
　　5.利用實時熒光定量 PCR檢測轉染后孕鼠胎盤組織 ILK基因的mRNA水平表達;
　　6.利用免疫印跡法檢測轉染前后孕鼠胎盤組織 ILK基因的蛋白水平表達;
　　7.利用CD34因子免疫組化實驗檢測孕17天大鼠轉染后的胎盤血管密度

11、。
　　結果：
　　1.實驗選取的30只孕鼠,麻醉及感染死亡4只,早產1只;
　　2.轉染后胎盤組織的冰凍切片在熒光下觀察可見 GFP大面積高表達,體內轉染效果理想;
　　3.體內轉染后,轉染組孕鼠的胎盤重量為(0.83±0.12)g,陰性對照組(0.86.±0.23)g,空白對照組(0.79.±0.41)g,轉染組與陰性對照組相相比,差異無統(tǒng)計學意義(p>0.05);
　　4.轉染后各組胎盤中ILK mR

12、NA的表達水平,轉染組為1.352±0.31,陰性對照組為0.757±0.47,空白對照組為0.693±0.46。各組分別比較,實驗組與陰性對照組 ILK mRNA的表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);陰性對照組與空白對照組 ILK mRNA的表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);
　　5.轉染后各組胎盤中ILK蛋白的表達水平,轉染組為0.93±0.45,陰性對照組為0.48±0.32,空白對照組為0.54±0.41。實驗組

13、與陰性對照組相比,ILK蛋白的表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);陰性對照組與空白對照組相比,ILK蛋白的表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);
　　6.轉染組孕鼠胎盤的微血管數(shù)量(78.4±5.03)較陰性對照組(64.2±3.15)顯著增多;陰性對照組與空白對照組(60.1±6.34)相比,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　結論：
　　利用體內腺病毒轉染技術可有效增加 ILK基因在孕鼠胎盤 mRNA和蛋