整合素連接激酶在喉鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生中的作用及其與PTEN、AKT1-PKB關(guān)系的研究.pdf

1、喉部惡性腫瘤約占耳鼻咽喉惡性腫瘤的7.9％-35％。而喉部惡性腫瘤以鱗狀細(xì)胞癌最為多見(jiàn)，約占90％。近40年來(lái)，喉癌的發(fā)病率有增長(zhǎng)趨勢(shì)。明確喉癌原因及機(jī)制，以期做到早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療，提高患者的生存率和生活質(zhì)量，進(jìn)而提高社會(huì)效益，無(wú)疑有著重大意義。 近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，許多癌基因和抑癌基因相關(guān)產(chǎn)物為細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的成員。因此,新的觀點(diǎn)認(rèn)為細(xì)胞癌變是由于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑異常，細(xì)胞接受了異常生長(zhǎng)、增殖、分化信號(hào)所致

2、。細(xì)胞粘附移行的變化在腫瘤的形成、浸潤(rùn)和播散中起重要作用。腫瘤細(xì)胞之間、腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附是由不同的粘附分子來(lái)，介導(dǎo)的。 整合素(integrins)是所知的粘附分子中重要的一類，整合素和生長(zhǎng)因子受體參與介導(dǎo)了這些相互作用，尤其是在上皮性腫瘤中，整合素在基底上層的表達(dá)與腫瘤的形成密切相關(guān)，其表達(dá)可預(yù)示臨床侵襲性病程的早期復(fù)發(fā)。而偶聯(lián)這些受體與下游組分的胞內(nèi)效應(yīng)物對(duì)胞外基質(zhì)的信號(hào)傳導(dǎo)起

3、到關(guān)鍵作用。整合素連接激酶(integrin-linked kinase，ILK)就是其中之一。在ILK高表達(dá)的上皮細(xì)胞中的細(xì)胞形態(tài)改變顯著特征是：在軟瓊脂中不依賴貼壁生長(zhǎng)，對(duì)懸浮細(xì)胞凋亡的抑制，在胞外基質(zhì)中侵襲的增強(qiáng)，以及在裸鼠中成瘤。 AKT又稱蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)，是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。AKT與腫瘤發(fā)生有關(guān)，被逆轉(zhuǎn)錄病毒癌基因P13K變構(gòu)的細(xì)胞可表現(xiàn)出持續(xù)的AKT活性而易發(fā)

4、生癌變，而用顯性失活A(yù)KT等位基因轉(zhuǎn)染的這些細(xì)胞卻能逆轉(zhuǎn)其致癌的變構(gòu)，提示AKT與腫瘤的發(fā)生相關(guān)。PTEN已被證實(shí)為一種人類腫瘤抑制因子，是一個(gè)蛋白和磷脂磷酸酶。目前研究顯示，ILK在PTEN依賴的細(xì)胞周期調(diào)控中起非常重要的作用。在許多人類癌癥中，PTEN具有極高的突變率。由于許多與癌癥相關(guān)的突變都位于PTEN磷酸酶催化結(jié)構(gòu)域，可以認(rèn)為，PTEN磷酸酶活性對(duì)于其作為腫瘤抑制物的功能是必須的。研究證實(shí)，它的缺乏與AKT活性增加有關(guān)。

5、 關(guān)于ILK mRNA、ILK蛋白在喉鱗癌中表達(dá)的研究國(guó)內(nèi)外較少，而關(guān)于ILK、AKTl和PTEN在LSCC中的表達(dá)及其與LSCC侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)性研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究選取64例LSCC組織標(biāo)本，應(yīng)用RT-PCR、免疫組化方法和原位雜交方法檢測(cè)了LSCC中ILK mRNA、AKTI和PTEN的表達(dá)，研究ILK、AKTl和PTEN與LSCC腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)指標(biāo)的關(guān)系，并探討ILK、AKTl和PTEN參與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的可能作用機(jī)制。

6、 實(shí)驗(yàn)材料與方法 1．實(shí)驗(yàn)材料 LSCC標(biāo)本均來(lái)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院耳鼻喉科2003-2005年外科手術(shù)切除和活檢標(biāo)本，共64例，聲門上癌56例，聲門癌8例。其中男性54例，女性lO例，年齡42～78歲，平均年齡60.5歲。所有頸廓清標(biāo)本均做頸淋巴結(jié)連續(xù)切片。有頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移36例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移28例。正常對(duì)照10例取白喉癌旁>2cm處正常喉黏膜組織。所有組織均分為兩份，一份做石蠟包埋，病理切片進(jìn)行組織確認(rèn)，另

7、一份在離體半小時(shí)內(nèi)放人預(yù)先處理過(guò)的錫箔紙中置液氮罐中，再轉(zhuǎn)存到-70℃冰箱保存。 2．實(shí)驗(yàn)方法 (1)RT-PCR法檢測(cè)ILK的mRNA表達(dá)： 上游引物序列5’-GGA CCA CCG CAT CTC TAC AT-3’ 下游引物序列5’-GCA CTT TCT TCG CAG TTT CC-3’擴(kuò)增的目的片段大小為338bp。 參照GAPDH基因檢測(cè)逆轉(zhuǎn)錄效率，其引物序列分別為上游引物序列5

8、’-CTC AGA CAC CAT GGG GAA GGT GA-3’ 下游引物序列5’-ATA CTG TTG TCG GAG TTC AGT A-3’，擴(kuò)增的目的片段為450bp。 (2)原位雜交法檢測(cè)PTEN的基因表達(dá)。 (3)免疫組化法檢測(cè)ILK、AKTl的蛋白表達(dá)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1．ILK mRNA在LSCC組織中的表達(dá)明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

9、2．ILK mRNA在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中的表達(dá)明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，且有顯著性差異(P<0.05)。 3．根據(jù)UICCl997年標(biāo)準(zhǔn)對(duì)LSCC進(jìn)行TNM分期，隨著LSCC臨床TNM分期的發(fā)展，ILK mRNA的表達(dá)均相應(yīng)升高，但相鄰兩組間比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 4．ILK蛋白在正常喉黏膜組織及LSCC組織中的表達(dá)結(jié)果： 在64例15CC組織中ILK蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為72.0％，而10例正常喉

10、黏膜組織上皮細(xì)胞無(wú)一例呈陽(yáng)性表達(dá)，兩組間差異有顯著意義(P<0.05)。在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，其陽(yáng)性表達(dá)為91.6％(33/36)，而無(wú)轉(zhuǎn)移組的表達(dá)為46.4％(13/28)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有顯著意義(P<0.05)。ILK蛋白陽(yáng)性表達(dá)率與LSCC患者的臨床分期無(wú)明顯關(guān)系(P>0.05)。 5．ILK mRNA和ILK蛋白在LsCC組織中表達(dá)的比較： 采用RT-PCR方法對(duì)ILK mRNA進(jìn)行半定量分析的結(jié)果與免疫組化分析

11、結(jié)果一致，即ILK在15CC組和對(duì)照組間均有顯著性差異，同時(shí)與有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，而與15CC患者的臨床分期均無(wú)明顯關(guān)系。 6．AKTl蛋白在LSCC組織中陽(yáng)性表達(dá)率為69.0％，而10例正常喉黏膜組織上皮細(xì)胞無(wú)一例呈AKTl陽(yáng)性表達(dá)。AKTl蛋白陽(yáng)性表達(dá)率與15CC患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的有無(wú)、臨床分期均無(wú)明顯關(guān)系(p>0.05)。 7．在LSCC組織中PTEN mRNA陽(yáng)性表達(dá)率為14.0％，陽(yáng)性染色主要定位

12、于癌細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，少部分位于細(xì)胞核。VFEN mRNA在10例正常組織黏膜上表達(dá)均為陽(yáng)性，表達(dá)率為100％。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 8．LSCC組織中AKTl和PTEN蛋白表達(dá)相關(guān)性分析 64例LSCC中，相關(guān)性分析顯示AKTI表達(dá)與ILK表達(dá)顯著正相關(guān)，而AKTl與PTEN、ILK與PTEN呈弱負(fù)相關(guān)。 1．ILK tuRNA和ILK蛋白在LSCC組織中呈過(guò)表達(dá)，并與有無(wú)淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移相關(guān)，提

13、示ILK與LSCC的發(fā)生轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。 2．抑癌基因PTEN在LSCC的失表達(dá)可導(dǎo)致信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑異常，引起AKTl的過(guò)表達(dá)，與喉癌的發(fā)生相關(guān)。 3．ILK、AKTl及PTEN的表達(dá)情況可作為L(zhǎng)SCC發(fā)生早期的診斷和轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)指標(biāo)和LSCC患者預(yù)后的可參考指標(biāo)。 4．通過(guò)對(duì)ILK、PTEN及AKTl的研究，提示我們可以尋求一種基因治療方法，恢復(fù)或替代缺失(突變)基因PTEN的功能，或抑制ILK的功能以阻止喉鱗癌的發(fā)