RNA結(jié)合蛋白GPKOW在人前體mRNA剪接中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：RNA依賴的ATP水解酶DHX16屬于DEXD/H-box解旋酶家族，在人前體mRNA（pre-mRNA）剪接過程中，催化ATP，促進(jìn)剪接體復(fù)合物B向復(fù)合物C轉(zhuǎn)化，為人pre-mRNA剪接過程所必需。研究發(fā)現(xiàn)，DEXD/H-box解旋酶水解ATP的功能常依賴相互作用蛋白的刺激與調(diào)控。在人類細(xì)胞中，是否也存在DHX16的作用蛋白，能夠調(diào)控DHX16蛋白的ATP水解功能，至今尚不清楚。課題組前期以剪接因子DHX16為誘餌蛋白，應(yīng)用酵母

2、雙雜交技術(shù)，成功捕獲了GPKOW蛋白。在前期的研究基礎(chǔ)上，本研究旨在檢測GPKOW與RNA結(jié)合及與DHX16蛋白相互作用的特點(diǎn)，鑒定GPKOW蛋白是否為人類剪接體新成員，為人pre-mRNA剪接過程所必需，并在實驗結(jié)果上，探討GPKOW與DHX16蛋白相互作用在人pre-mRNA剪接過程中可能的作用機(jī)制。
　　方法：利用基因工程技術(shù)克隆GPKOW基因，并構(gòu)建GPKOW的截斷突變體和點(diǎn)突變體；在大腸桿菌DE3 pLysS系統(tǒng)以IPT

3、G誘導(dǎo)表達(dá)His6-GPKOW融合蛋白，結(jié)合鈷親和樹脂和poly（U）瓊脂糖珠親和層析法純化His6-GPKOW融合蛋白；應(yīng)用Northwestern和EMSA檢測GPKOW蛋白與RNA結(jié)合；通過pull down和免疫共沉淀方法檢測GPKOW與DHX16體外相互結(jié)合，并以體內(nèi)剪接分析方法檢測GPKOW在剪接過程中調(diào)控DHX16功能；提取HeLaS3細(xì)胞核，通過體外剪接分析方法鑒定GPKOW蛋白為人剪接體新成員，以及體外剪接體復(fù)合物分析

4、方法確定GPKOW蛋白在剪接過程發(fā)揮作用的關(guān)鍵階段。
　　結(jié)果：
　　1.人GPKOW蛋白與不同物種包括牛蛙(Q6NU07)、斑馬魚（Q90X38）及小鼠(Q56A08)的GPKOW同系物進(jìn)行比對發(fā)現(xiàn)，GPKOW蛋白在G-patch、KOW1及KOW2結(jié)構(gòu)域上有高度的保守性；
　　2.經(jīng)酶切分析和測序結(jié)果顯示，成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a(+)/His6-GPKOW和pEGFP-C1-GPKOW；重組質(zhì)粒pET28a(

5、+)/His6-GPKOW-△N，-△C，-△M及-△NC截斷突變體；pET28a(+)/His6-GW和-GK點(diǎn)突變體及pEGFP-C1-GW和-GK點(diǎn)突變體；
　　3.結(jié)合鈷柱和poly（U）瓊脂糖珠親和層析法純化His6-GPKOW融合蛋白，經(jīng)15％SDS-PAGE凝膠分離，考馬斯亮藍(lán)染色，結(jié)果可見蛋白純度高，未見明顯背景蛋白；
　　4.分離HeLa細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)蛋白成分，通過Western blotting鑒定GPK

6、OW屬于細(xì)胞核成分；熒光顯微鏡觀察GFP-GPKOW定位于細(xì)胞核，呈彌漫分布；
　　5.Northwestern和EMSA方法確定GPKOW與體外轉(zhuǎn)錄合成的U2，U4，U5，U6 snRNA及pre-mRNA pRG1結(jié)合，KOW1結(jié)構(gòu)域突變影響GPKOW-RNA結(jié)合；6.Pull down和免疫共沉淀結(jié)果顯示GPKOW與DHX16蛋白體外相互結(jié)合， G-patch結(jié)構(gòu)域突變導(dǎo)致GPKOW喪失與DHX16結(jié)合的能力，且RNA酶A消

7、化細(xì)胞提取物的RNA后不影響GPKOW與DHX16體外相互結(jié)合，GPKOW與DHX16蛋白在正常生理鹽濃度下相互結(jié)合，但NaCl鹽濃度升高到0.3 M和0.5 M，可破壞GPKOW與DHX16蛋白相互結(jié)合；
　　7.體內(nèi)剪接分析顯示GPKOW能改善DHX16優(yōu)勢突變體引起的pre-mRNA剪接缺陷，但不能改善呢亞霉素（MMS）引起的pre-mRNA剪接缺陷，GPKOW調(diào)控DHX16蛋白功能是特異的；
　　8.GPKOW野生型

8、和G-patch結(jié)構(gòu)域點(diǎn)突變體GPKOW-GW可以部分改善DHX16優(yōu)勢突變體引起的pre-mRNA剪接缺陷，而KOW1結(jié)構(gòu)域點(diǎn)突變體GPKOW-GK失去抑制DHX16優(yōu)勢突變體引起的pre-mRNA剪接缺陷的功能；
　　9.應(yīng)用純化的His6-GPKOW融合蛋白作為抗原，皮下注射抗原免疫刺激新西蘭雌兔，獲得抗全長GPKOW抗體血清；
　　10.Anti-GPKOW抗體可以免疫共沉淀pre-mRNA、中間剪接產(chǎn)物，U1、U2

9、和U6 snRNA；
　　11.應(yīng)用抗全長GPKOW抗體血清免疫共沉淀法去除HeLaS3 NE中的GPKOW蛋白，導(dǎo)致pre-mRNA剪接缺陷，同時引起剪接體復(fù)合物Bact聚集；
　　12.純化的GPKOW野生型和G-patch結(jié)構(gòu)域點(diǎn)突變體GPKOW-GW回補(bǔ)到去除GPKOW蛋白的HeLaS3 NE中，能夠恢復(fù)剪接功能，但相同量的KOW1結(jié)構(gòu)域點(diǎn)突變體GPKOW-GK只能相對地部分恢復(fù)剪接功能。
　　結(jié)論：
　

10、　1.成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a(+)/His6-GPKOW和pEGFP-C1-GPKOW；
　　2.成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a(+)/His6-GPKOW-△N，-△C，-△M及-△NC截斷突變體；pET28a(+)/His6-GK和-GW點(diǎn)突變體；pEGFP-C1-GK和-GW點(diǎn)突變體。
　　3.結(jié)合鈷柱和poly（U）瓊脂糖珠親和層析純化法獲得高純度的His6-GPKOW融合蛋白；
　　4.GPKOW定位于細(xì)

11、胞核，為RNA結(jié)合蛋白，通過KOW1結(jié)構(gòu)域與RNA結(jié)合；
　　5.GPKOW通過G-patch結(jié)構(gòu)域與DHX16蛋白在體外相互結(jié)合，這種結(jié)合不依賴RNA，且具有鹽濃度敏感性；
　　6.GPKOW蛋白在剪接反應(yīng)中與pre-mRNA、剪接產(chǎn)物及snRNAs相聯(lián)系；
　　7.GPKOW是人類剪接蛋白及為人pre-mRNA剪接過程所必需；
　　8.GPKOW蛋白在剪接體復(fù)合物Bact轉(zhuǎn)變成剪接體復(fù)合物C的過程發(fā)揮功能；<