RBM5蛋白在mRNA選擇性剪接中作用機(jī)制的研究.pdf

1、真核生物細(xì)胞中基因的表達(dá)受到mRNA剪接的調(diào)控,而mRNA選擇性剪接保證了細(xì)胞中功能蛋白的多樣性。在真核細(xì)胞中,mRNA剪接調(diào)控的精確性和有效性至關(guān)重要,而mRNA剪接缺陷往往和許多人類疾病相關(guān)。RBM5蛋白最初作為腫瘤抑制因子而被發(fā)現(xiàn),RBM5蛋白過(guò)表達(dá)能夠通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞周期進(jìn)程影響細(xì)胞的分裂增殖。近年來(lái),有研究發(fā)現(xiàn)RBM5蛋白參與Fas、Caspase-2等細(xì)胞凋亡相關(guān)基因mRNA的選擇性剪接調(diào)控,但是具體調(diào)控機(jī)制仍然不

2、清楚。因此,本研究的主要目的在于探究RBM5參與mRNA選擇性剪接調(diào)控的可能機(jī)制,為更好地理解RBM5的生物學(xué)功能提供線索。
　　 1.RBM5蛋白對(duì)hAID mRNA選擇性剪接的調(diào)控
　　 AID(Activation Induced Deaminase,活化誘導(dǎo)胞嘧啶核苷脫氨酶)是B細(xì)胞中類別轉(zhuǎn)換(classs switch recombination)和體細(xì)胞高頻突變(somatichypermutation)兩個(gè)

3、過(guò)程所必需的,然而AID的不正常表達(dá)和B細(xì)胞淋巴瘤、肺癌、直腸癌等腫瘤的發(fā)生有密切關(guān)系。近年來(lái),有研究發(fā)現(xiàn)AID mRNA選擇性剪接是其生物學(xué)功能的重要調(diào)控環(huán)節(jié)。為了研究AID選擇性剪接的調(diào)控機(jī)制,首先構(gòu)建了含人AID第3、4、5外顯子對(duì)應(yīng)基因組DNA片段的真核表達(dá)載體。研究發(fā)現(xiàn)RBM5能夠調(diào)控上述AID迷你基因的選擇性剪接,促進(jìn)外顯子4的跳躍。我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),RBM5蛋白的調(diào)控功能依賴于內(nèi)含子3的3’剪接位點(diǎn)的強(qiáng)度。體外遷移率變動(dòng)分析

4、(gel mobility shift assay)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,RBM5重組蛋白在體外能夠結(jié)合AID mRNA,很可能是通過(guò)結(jié)合在內(nèi)含子3的3’剪接位點(diǎn)上游發(fā)揮作用,提示RBM5蛋白可能通過(guò)結(jié)合在受調(diào)控外顯子相關(guān)上游3’剪接位點(diǎn)附近,阻止剪接復(fù)合體對(duì)該3’剪接位點(diǎn)的識(shí)別,從而抑制相應(yīng)內(nèi)含子的剪切,促進(jìn)外顯子跳躍。
　　 2.關(guān)于RBM5蛋白相互作用的研究
　　 mRNA剪接調(diào)控一般是通過(guò)RNA—RNA、RNA-蛋白、蛋

5、白-蛋白相互作用實(shí)現(xiàn)的。為了探尋與RBM5剪接調(diào)控相關(guān)的蛋白,本研究首先通過(guò)親和純化的方法從HeLa細(xì)胞核抽提物中分離了RBM5蛋白復(fù)合物,質(zhì)譜分析鑒定出兩個(gè)新的RBM5結(jié)合蛋白:DHX15和PRP19。免疫共沉淀和體外GST pulldown實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了RBM5蛋白能夠結(jié)合DHX15和PRP19。已有研究表明,人DHX15的酵母同源蛋白Prp43p主要參與剪接體的解聚及核糖體rRNA的成熟,但DHX15在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的作用目前尚不

6、清楚。鑒于此,我們對(duì)RBM5與DHX15相互作用及其生物學(xué)意義進(jìn)行更為深入的探索。首先,酵母雙雜交和免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),RBM5 C端結(jié)構(gòu)域是RBM5與DHX15間相互作用所必需的。進(jìn)一步的點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,RBM5 C端的Gpatch結(jié)構(gòu)域?qū)τ赗BM5與DHX15間的相互作用起到重要作用。
　　 最后,通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)首次證實(shí)DHX15在體外具有解旋酶活性,而RBM5通過(guò)其G patch結(jié)構(gòu)域促進(jìn)DHX15的解旋酶活性。本研