FMRP參與前體mRNA的選擇性剪接調(diào)控及其在脆性X綜合征發(fā)病機制中的作用.pdf

1、【目的】脆性X綜合征（FXS）是常見的遺傳性智力低下疾病之一，其發(fā)病的主要原因是由于FMR1基因5′端非編碼區(qū)（C GG） n三核苷酸重復序列不穩(wěn)定擴增及其相鄰部位CpG島異常甲基化使FMR1基因轉(zhuǎn)錄失活，導致其編碼的產(chǎn)物——脆性X智力低下相關(guān)蛋白F M RP表達減少或缺失而引起。該病的臨床表現(xiàn)包括發(fā)育遲滯，不同程度的智力低下、注意力缺陷、多動癥及孤獨癥樣表現(xiàn)等。FMRP在腦組織中表達豐富，它作為一種選擇性RNA結(jié)合蛋白，能與大量mRN

2、 A結(jié)合，從轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控一系列mRN A的翻譯過程。過去已證實 FMRP是一種多功能蛋白，從多種途徑參與基因的表達調(diào)控。本研究通過免疫共沉淀聯(lián)合質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MRP與選擇性剪接調(diào)控因子RBM14有直接相互作用。因此，推測FMRP通過與RBM14相互作用選擇性參與調(diào)節(jié)部分基因的選擇性剪接過程。本研究通過選定多個突觸可塑性相關(guān)基因作為靶基因，采用熒光定量PCR的方法檢測FVB小鼠海馬組織及小鼠Neuro-2a細胞中各個靶基因剪接異構(gòu)體的

3、表達量。通過比較各個剪接異構(gòu)體表達含量的比值，以明確FMRP對各個靶基因中相關(guān)盒式外顯子的選擇性剪接調(diào)控作用。以期探索FM RP參與的選擇性剪接調(diào)控機制及其在 FXS病理生理過程中的可能作用，為進一步闡明FXS發(fā)病機制提供新的理論依據(jù)。
　　【方法】
　　1、利用FVB小鼠海馬組織進行蛋白免疫共沉淀實驗，聯(lián)合質(zhì)譜分析，檢測小鼠體內(nèi)FMRP相互作用蛋白的情況；
　　2、提取不同發(fā)育時期FVB小鼠海馬組織總蛋白、總RNA，

4、采用Western blot檢測Fmr1 WT鼠及KO鼠海馬組織中RBM14的表達情況，采用qRT-PCR檢測Fmr1 WT鼠及KO鼠海馬組織中各個靶基因剪接異構(gòu)體的表達量；
　　3、利用FMRP干擾、過表達質(zhì)粒及RBM14干擾表達質(zhì)粒（以及相應對照質(zhì)粒）轉(zhuǎn)染Neuro-2a細胞，轉(zhuǎn)染48小時之后提取細胞總RNA，采用qRT-PCR檢測Neuro-2a細胞中各個靶基因剪接異構(gòu)體的表達量；
　　4、構(gòu)建Protrudin-L（

5、包含ExL）、Protrudin-S（Ex L缺失）、Tau-L（包含Ex10）、Tau-S（Ex10缺失）綠色熒光表達質(zhì)粒（以及相應對照質(zhì)粒），轉(zhuǎn)染Neuro-2a細胞后，經(jīng)反式-維甲酸誘導分化后，在熒光顯微鏡下觀察細胞突起生長的情況。
　　【結(jié)果】
　　1、采用FVB小鼠海馬組織進行CO-IP實驗，聯(lián)合質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MRP可結(jié)合RBM14，并通過Western blot得到驗證；
　　2、在三個發(fā)育時期（E18、

6、P7、P60），F(xiàn)mr1 WT鼠與KO鼠海馬組織中RBM14的表達無明顯差異；在 E18、P60時期， Fmr1 KO鼠海馬組織中Protrudin-S/Protrudin-L比值上升，Tau-S/Tau-L比值下降，差異均具有統(tǒng)計學意義，在P7時期則均無明顯差異；NCAM-S/NCAM-L比值在三個時期均無統(tǒng)計學差異；
　　3、Neuro-2a細胞干擾表達FMRP或 RBM14后，Protrudin-S/Protrudin-L比

7、值上升，Tau-S/Tau-L比值下降，差異均具有統(tǒng)計學意義；NCAM-S/NCAM-L比值變化均無統(tǒng)計學差異；
　　4、Neuro-2a細胞過表達 FMRP后，Protrudin-S/Protrudin-L比值下降， Tau-S/Tau-L比值上升，差異均具有統(tǒng)計學意義；NCAM-S/NCAM-L比值變化無統(tǒng)計學差異；Neuro-2a細胞過表達 FMRP，同時干擾表達 RBM14后， Protrudin-S/Protrudin-

8、L、Tau-S/Tau-L和NCAM-S/NCAM-L比值變化均無統(tǒng)計學差異；
　　5、Protrudin-L、Protrudin-S、Tau-L、Tau-S綠色熒光表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Neuro-2a細胞經(jīng)誘導分化后，Protrudin-L和Tau-S轉(zhuǎn)染組細胞突起顯著延長，差異均具有統(tǒng)計學意義。
　　【結(jié)論】本研究首次證實 FMRP通過與選擇性剪接相關(guān)蛋白 RBM14結(jié)合，參與pre-mRNA選擇性剪接過程，而且FMRP表達改變