遺傳性智障脆性X綜合征發(fā)病分子機(jī)制研究.pdf

1、脆性X綜合征(Fragile X syndrome，F(xiàn)XS)是常見的遺傳性智力低下疾病之一。臨床表現(xiàn)多樣，主要表現(xiàn)為中到重度的智力低下，常伴有巨睪、特殊面容、多動癥、癲癇發(fā)作，大量患者腦電圖存在特征性彌漫性瞬間慢波發(fā)放等臨床病理表現(xiàn)。超過99％的FXS是由位于Xq27.3的脆性X智力低下基因1(fragile X mental retardation 1，F(xiàn)MRl)5'端非編碼區(qū)(CGG)<,n>三核苷酸重復(fù)序列的異常擴(kuò)增及CpG島的異

2、常甲基化引起FMRl編碼產(chǎn)物脆性X智力低下蛋白(fragile X mental retardation protein，F(xiàn)MRP)的表達(dá)下降或缺失所導(dǎo)致。 分別定位于3q28及17p13.1的脆性x相關(guān)基因1/2(fragile X related gene 1/2，F(xiàn)XR1/2)被發(fā)現(xiàn)與FMR1具有高度的序列及結(jié)構(gòu)相似性，且可兩兩以同源或異源二聚體形式存在，三者統(tǒng)稱為脆性X基因家族。FXR1/2類似于FMRl也具有與蛋白質(zhì)結(jié)

3、合的功能及與mRNA結(jié)合的功能，而且本身也可以與FMRl mRNA、FMRP相互作用，可能與FXS的發(fā)病密切相關(guān)。 目前的研究提示，脆性X綜合征的發(fā)病與FMR1、FXRl/2三個基因相關(guān)，且三者存在相互作用，故本論文圍繞FMR1、FXR1這兩個基因(FXR2目前僅構(gòu)建了基因載體)分四個部分開展了FXS發(fā)病分子機(jī)制的研究。首先，對于FMR1基因，主要應(yīng)用酵母三雜交技術(shù)從表達(dá)調(diào)控的角度在蛋白質(zhì)表達(dá)文庫中篩選FMR1 mRNA 3'-

4、非翻譯區(qū)的調(diào)控蛋白，并且通過建立高效快速的診斷方法，研究不同種族此基因結(jié)構(gòu)的差異；對于FXR1基因，則通過應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選并經(jīng)免疫共沉淀驗證FXR1P的相互作用蛋白；最后應(yīng)用酵母三雜交系統(tǒng)在RNA表達(dá)文庫中篩選能與FXR1P相互作用的mRNA，以期能找到一些從基因表達(dá)異常到臨床發(fā)病的相關(guān)環(huán)節(jié)或網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，初步構(gòu)建蛋白質(zhì).蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-mRNA相互作用網(wǎng)絡(luò)調(diào)控圖譜，為揭示FXR1P的功能及其與脆性X綜合征的發(fā)病機(jī)制的關(guān)系提供新的線索

5、。 四部分研究內(nèi)容、意義及結(jié)果如下： FMRl基因5'-非翻譯區(qū)(CGG)<,n>重復(fù)數(shù)目是臨床上診斷FXS的重要標(biāo)準(zhǔn)，建立一種(CGG)<,n>重復(fù)數(shù)目的確定方法對FXS的高效快速篩查和產(chǎn)前診斷具有重要意義，研究中國不同種族(CGG)<,n>重復(fù)序列的多態(tài)性可助進(jìn)一步闡明FMR1基因的遺傳特征，針對FMR1的5'端GC堿基高度富集，DNA雙鏈較難解鏈，本研究采用了耐高溫酶及堿基替代法、PCR增效劑的添加及提高退火溫度，

6、改善擴(kuò)增條件，對FMRl基因中GC含量較高的重復(fù)序列進(jìn)行擴(kuò)增，分別對漢族與壯族人群FXS遺傳性標(biāo)記序列的多態(tài)性進(jìn)行研究，建立了一種穩(wěn)定快速、適合大規(guī)模正常人群檢測(CGG)<,n>重復(fù)數(shù)及研究其多態(tài)性的方法。發(fā)現(xiàn)漢族人群和壯族人群X染色體(CGG)<,n>重復(fù)數(shù)最大值分別為28及29。 FMR1基因在翻譯水平上的表達(dá)調(diào)控異?？赡軐?dǎo)致FXS患者FMR1的表達(dá)水平下降，因此篩選FMR1基因的mRNA3'UTR相互結(jié)合蛋白的工作對于闡明FXS

7、發(fā)病機(jī)理也具有探索性的意義。本研究構(gòu)建了酵母三雜交系統(tǒng)pRH3/FMR1 mRNA 3'UTR的Bait質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染酵母菌株L40-ura3/pHtybLex/Zeo-MS2，共轉(zhuǎn)化法從人腦海馬回pYESTrp3-cDNA文庫中篩選了FMR1 mRNA 3'UTR的作用蛋白，將獲得的陽性質(zhì)粒與誘餌質(zhì)粒重新轉(zhuǎn)入酵母菌內(nèi)，對RNA-蛋白質(zhì)作用進(jìn)行一對一驗證，對驗證后的陽性克隆的外源性片斷進(jìn)行測序及同源性分析，發(fā)現(xiàn)了兩種可能與 FMR1 mRN

8、A 3'UTR具有相互作用的蛋白：K-Alpha-1及Homo sapiens hypothetical protein，我們推測這兩種蛋白可能通過與FMRl mRNA 3'UTR相互結(jié)合而在翻譯水平上對FMR1進(jìn)行表達(dá)調(diào)控。 FXR1基因編碼蛋白的系列相互作用蛋白的篩選以及驗證將有助于FXR1基因功能的闡明。本實驗構(gòu)建了酵母雙雜交系統(tǒng)誘餌質(zhì)粒pGBKT7-FXR1，并將其轉(zhuǎn)化酵母菌AH109，與轉(zhuǎn)化了Matchmaker人胎腦

9、pGADT7-cDNA文庫質(zhì)粒的酵母菌Y187進(jìn)行配合(Mating)，通過一系列報告基因的表達(dá)檢測篩選陽性克隆，將經(jīng)酶切鑒定后陽性克隆質(zhì)粒AD/Library轉(zhuǎn)化Y187再與誘餌質(zhì)粒pGBKT7-FXR1酵母菌進(jìn)行一對一小交配驗證蛋白質(zhì)的相互作用，真陽性克隆的AD/Library質(zhì)粒測序及生物信息學(xué)分析，一共得到了七種可能與FXRlP相互作用的蛋白：Btf,SAFB，CMAS，F(xiàn)TH1，GOLGA4，HSD1781，CSH1；隨后進(jìn)行

10、的免疫共沉淀驗證實驗，構(gòu)建了4個真核表達(dá)載體pCMV-FXR1-Myc，pCMV-Flag-FXR1.pCMV-Btf-Myc，pCMV-SAFB-Myc，對FXR1P與Btf、SAFB的相互作用進(jìn)行了哺乳動物細(xì)胞內(nèi)的免疫共沉淀驗證，發(fā)現(xiàn)FXR1P與SAFB不能在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生相互作用，而能夠與Btf相互作用。據(jù)此，可以認(rèn)為Btf是FXR1P蛋白調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的新成員，在神經(jīng)、肌肉等組織生長發(fā)育過程中發(fā)揮一定的作用。 FXR1基因編碼蛋白

11、的系列相互作用靶mRNA的篩選有助于FXR1P的表達(dá)調(diào)控功能與FXS發(fā)病機(jī)制的探討。本研究應(yīng)用酵母三雜交技術(shù)以構(gòu)建好的誘餌質(zhì)粒pYESTrp3/FXR1從人腦海馬回pRH3'-cDNA文庫(RNA表達(dá)文庫)中對FXR1P的相互作用mRNA進(jìn)行了篩選，得到56個His<'+>和LacZ<'+>陽性克隆，將初步獲得的陽性質(zhì)粒與誘餌質(zhì)粒一對一重新轉(zhuǎn)入酵母體內(nèi)，對RNA-蛋白質(zhì)相互作用進(jìn)行回轉(zhuǎn)驗證，共獲得9個陽性克隆。最后對陽性克隆測序并進(jìn)行同