遺傳性心律失常的分子機制研究.pdf

1、早期復極是一種常見的心電圖現(xiàn)象,主要表現(xiàn)為J點抬高或J波增大,QRS-ST間切跡、頓挫,常伴ST段抬高和T波直立。在年輕男性、運動員以及黑人中多見。半世紀以來,人們一直將其視為一種良性的生理性變異。然而,近期研究表明,早期復極可能與惡性心律失常以及猝死相關,且存在早期復極者發(fā)生猝死的危險與J波與ST段抬高出現(xiàn)的導聯(lián)及其抬高的幅度有關。在此基礎上,Antzelevitch和Yan提出了一個新的概念用來描述這一心電現(xiàn)象,即遺傳性J波綜合征。

2、根據心電圖上J波出現(xiàn)的導聯(lián)和患者的臨床預后,進一步將遺傳性J波綜合征分為四個亞型:(1)Ⅰ型早期復極綜合征(early repolarization syndrome,ERS):早期復極J波定位于前側壁V4～V6導聯(lián),一般為良性變異；(2)Ⅱ型ERS:早期復極J波定位于下壁Ⅱ、Ⅲ、aVF導聯(lián),易發(fā)生室速或室顫；(3)Ⅲ型ERS:早期復極J波定位于全心室,包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、aVL、aVF以及V1～V6導聯(lián),極易發(fā)生室速或室顫；(4)Brug

3、ada綜合征:右側胸前區(qū)V1～V3導聯(lián)出現(xiàn)典型的Brugada波,易發(fā)生室速或室顫。研究表明,CACNA1C、CACNB2和CACNA2D1基因突變或KCNJ8基因突變導致的“功能增強”(gain-of-function)可能與ERS的發(fā)病相關。
　　 目的:
　　 定位一個ERS家系的致病基因；識別基因突變位點；在細胞和分子水平上研究該突變對其編碼的蛋白質的功能的影響并探討基因突變致ERS的發(fā)病機制。
　　 方

4、法:
　　 收集ERS家系及500例無血源關系的健康對照者的外周靜脈血。采用候選基因策略對先證者SCN5A、KCND3、CACNA1C、CACNB2、KCNE3、SCN1B和KCNJ8基因的全部外顯子和外顯子-內含子結合部位進行篩查,以期發(fā)現(xiàn)致病基因。然后,分別在ERS家系和健康對照者中篩查所發(fā)現(xiàn)的基因突變,評估該突變在人群中出現(xiàn)的頻率。在野生型質粒的基礎上,利用定點突變技術構建突變體質粒。采用全細胞膜片鉗技術在轉染野生型或突變

5、體質粒的HEK293細胞上記錄通道電流,研究相應通道的電生理功能。采用實時定量PCR方法研究野生型或突變體通道蛋白mRNA的表達情況。應用免疫熒光共聚焦顯微鏡定性檢測野生型或突變體通道蛋白在細胞膜和細胞漿內的分布情況。
　　 結果:
　　 先證者,女,19歲。反復性暈厥4年。暈厥前心電圖檢查顯示在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、aVF和V2～V6導聯(lián)上出現(xiàn)廣泛的大J波以及ST段弓背向下型抬高,隨即室顫發(fā)作?；€心電圖檢查顯示在下壁Ⅱ、Ⅲ、a

6、VF導聯(lián)上可見到駝峰樣的小J波?；蛐头治霭l(fā)現(xiàn),先證者SCN5A基因上存在兩個新的基因變異,即G4297C和T5457C。前者為錯義突變,該突變導致位于鈉通道α亞基第三結構域的孔形成區(qū)和S6跨膜區(qū)之間細胞外環(huán)處的第1433位氨基酸殘基由甘氨酸變?yōu)榫彼?。而后者為一同義多態(tài)性,該多態(tài)性并未引起氨基酸序列的改變。采用全細胞膜片鉗技術在瞬時轉染野生型和突變體鈉通道的HEK293細胞上記錄鈉電流(sodium current,INa),發(fā)現(xiàn)與野

7、生型通道相比,G4297C突變不僅導致鈉通道的電流密度明顯下降,而且改變了鈉通道的動力學特性,使其穩(wěn)態(tài)激活曲線右移、半激活電壓變大、激活速度變慢以及穩(wěn)態(tài)失活后恢復時間延長。實時定量PCR結果表明,野生型和G4297C突變體鈉通道的mRNA的表達水平相當。然而,免疫熒光共聚焦實驗發(fā)現(xiàn),與野生型鈉通道不同,G4297C突變體通道在細胞膜上的熒光表達量顯著降低。進一步,在細胞漿中也未測到可見熒光,說明G4297C突變并未引起鈉通道轉運缺陷,而

8、是可能通過影響鈉通道轉錄后的翻譯過程或者加速鈉通道蛋白的降解,從而引起細胞膜上的鈉通道蛋白數(shù)量減少。此外,研究表明,當G4297C突變和T5457C多態(tài)性位于同一條鏈上時,T5457C多態(tài)性對G4297C突變具有部分拯救作用,可使突變體鈉通道的電流密度部分得到恢復,但對其通道動力學特性無影響。實時定量PCR結果顯示,G4297C-T5457C-SCN5A突變體通道m(xù)RNA的表達水平約為G4297C突變體通道的6倍。此外,免疫熒光共聚焦實

9、驗結果也發(fā)現(xiàn),與單獨轉染G4297C突變體質粒相比,在轉染了G4297C-T5457C突變體質粒的HEK293細胞上,綠色熒光的表達量顯著增高,并且主要分布在細胞膜上。結合實時定量PCR結果,我們推測T5457c多態(tài)性對G4297C突變體鈉通道的拯救作用可能是通過增加突變體通道的mRNA水平,進而增加其在細胞膜上的表達量實現(xiàn)的。
　　 結論:
　　 1、SCN5A基因的G4297C突變通過多種機制導致鈉通道出現(xiàn)“功能減弱