遺傳性抗活化蛋白C癥家系的臨床和分子發(fā)病機(jī)制研究.pdf

1、背景1993年Dahlback等首次報(bào)道了抗活化蛋白C癥（Resistance to activatedprotein C，APC-R）。目前的研究證實(shí)，APC-R的主要分子學(xué)機(jī)制是凝血因子V（FV）基因突變導(dǎo)致氨基酸變異（FV Arg506Gln，F(xiàn)V Leiden），它是高加索人群中發(fā)生率最高的血栓危險(xiǎn)因素（遺傳性易栓癥）之一。但FV Leiden突變分布具有明顯的地域性差異，在我國(guó)、韓國(guó)和日本等亞洲國(guó)家，無(wú)論健康人或血栓患者，雖可

2、發(fā)現(xiàn)APC-R陽(yáng)性，但FV Leiden的檢出率幾乎為零，提示亞洲人群中可能存在除FVLeiden以外的其他與APC-R相關(guān)且伴高血栓傾向的基因缺陷。
　　 目的研究-遺傳性APC-R且伴靜脈血栓栓塞（venous thromboembolism，VTE）史的家系的臨床和分子發(fā)病機(jī)制，以期發(fā)現(xiàn)新的與APC-R相關(guān)的遺傳缺陷，并初步探討與新遺傳缺陷相關(guān)的凝血因子功能異常。
　　 方法：
　　 1.采集1例APC-R

3、陽(yáng)性的VTE患者（先證者）及家系成員（4例）的臨床資料和血液樣本，進(jìn)行系統(tǒng)的家系調(diào)查。
　　 2.采用凝固法檢測(cè).APC-R、蛋白S，采用發(fā)色底物法檢測(cè)蛋白C、抗凝血酶，采用一期法測(cè)定凝血因子Ⅴ、Ⅷ活性（FV：C、FⅧ：C）。
　　 3.采用：PCR-RELP和直接測(cè)序方法除外FV Leiden突變、FV Cambridge/HongKong突變。
　　 4.擴(kuò)增FV基因的25個(gè)外顯子，對(duì)其PCR產(chǎn)物直接測(cè)序，將

4、測(cè)序結(jié)果與Genebank已知的DNA序列進(jìn)行比較。
　　 5.在健康體檢者和血栓性疾病患者中篩查新發(fā)現(xiàn)的FV基因突變，比較兩者的等位基因頻率。
　　 6.將先證者血漿/標(biāo)準(zhǔn)血漿以不同比例與乏FV血漿混合后利用凝血法（COATEST（）APCTM Resistance：Kit）測(cè)定APC-sr值，初步探討異常FV導(dǎo)致APC-R的機(jī)制。
　　 結(jié)果：
　　 1.先證者為53歲女性，因左下肢腫痛、進(jìn)行性呼吸困

5、難，經(jīng)下肢血管彩超、CT肺血管造影等檢查，確診下肢深靜脈血栓和肺栓塞。經(jīng)查，患者除APC-R陽(yáng)性外，無(wú)其他常見(jiàn)的獲得性或遺傳性易栓因素。經(jīng)低分子肝素繼之口服華法林抗凝治療癥狀緩解，至今已隨訪16個(gè)月，VTE未復(fù)發(fā)。
　　 2.先證者的雙親非近親結(jié)婚，家族中曾有一姐2年死于“VTE”，其余成員均無(wú)血栓事件。5名家系成員中有4人（包括先證者）檢出APC-R陽(yáng)性，另1人為APC-R陰性；其余易栓指標(biāo)（包括抗磷脂抗體、PS、PC、AT-

6、Ⅲ、FVⅢ：C等）均陰性。確定為遺傳性APC-R家系，符合常染色體顯性遺傳規(guī)律。
　　 3.全部家系成員均未檢出FV Leiden和FV Cambridge/Hong Kong突變等常見(jiàn)引起APC-R的FV基因缺陷。
　　 4.測(cè)序結(jié)果經(jīng)比較，鑒定到2個(gè)突變位點(diǎn)，分別是：①第10外顯子中的第1628個(gè)核苷酸突變（G1628→A），導(dǎo)致第485個(gè)氨基酸置換（R485K）。FV R485K為一種已報(bào)道可能與APC-R相關(guān)的F

7、V基因突變，但該突變以純合狀態(tài)同時(shí)存在于該家系中所有成員，且其在健康體檢者和APC-R陰性的血栓性疾病患者中等位基因頻率（A）分別為64％、60％，兩者無(wú)顯著差異；②第13外顯子中的第2172個(gè)核苷酸突變（G2172→C），導(dǎo)致第666個(gè)氨基酸置換（E666D）。FV E666D為一新發(fā)現(xiàn)的FV基因突變，以雜合狀態(tài)存在于該家系中所有APC-R陽(yáng)性成員，而在陰性成員中則缺乏，在健康體檢者和APC-R陰性的血栓性疾病患者中也均未被檢出。FV

8、E666D位于APC水解FVa的第3個(gè)位點(diǎn)-Arg679附近，有可能通過(guò)干擾APC對(duì)FVa的水解引起APC-R。
　　 5.由于FVa對(duì)APC的敏感性與FV濃度無(wú)關(guān)，而APC輔因子活性可隨FV濃度增加而增加。利用含F(xiàn)V E666D突變蛋白的先證者血漿進(jìn)行的初步功能研究顯示，在FV比例很低的情況下（即FV為2.5％），先證者血漿與標(biāo)準(zhǔn)血漿的APC-sr值的差異不大，提示異常FV被APC滅活的敏感性與正常FV相當(dāng)；隨FV比例的增加，

9、先證者血漿的APC-sr值的增加幅度（即斜率）小于正常血漿，提示異常FV作為APC裂解FVⅢa的輔因子活性低于正常FV。
　　 結(jié)論：
　　 1.本研究發(fā)現(xiàn)并證實(shí)了我國(guó)首個(gè)伴有VTE家族史的遺傳性APC-R家系。
　　 2.在國(guó)際上首次發(fā)現(xiàn)FV基因第13外顯子E666D突變（FV E666D），此突變?cè)谠摷蚁邓蠥PC-R陽(yáng)性成員中以雜合狀態(tài)存在，在APC-R陰性家系成員、健康體檢者和APC-R陰性血栓患者中均未