遺傳性出血性毛細血管擴張癥與非遺傳性May-Hegglin異常的臨床-分子診斷及發(fā)病機制研究.pdf

1、目的：分析一個遺傳性出血性毛細血管擴張癥(HHT)家系成員的臨床特點,以提高對該病的認識和診斷水平。
　　 病例和方法：先證者為一52歲女性患者,反復(fù)鼻衄40余年,先證者之子10歲前即有反復(fù)鼻衄史。先證者及先證者之子均存在嘴唇粘膜、舌粘膜、雙手指掌面皮膚毛細血管擴張。根據(jù)出血癥狀、毛細血管擴張部位、家族史等建立了HHT的臨床診斷。對先證者進行血常規(guī)、大小便常規(guī)、肝腎功能等常規(guī)檢查,并行胸部CT、腹部B超及電子胃鏡等檢查,明確是否

2、存在內(nèi)臟受累；結(jié)合家系中其他成員情況,繪制該HHT家系遺傳系譜圖。
　　 結(jié)果：先證者自幼即有自發(fā)性鼻衄,嘴唇粘膜、舌粘膜、手指、手掌面皮膚有結(jié)節(jié)狀血管瘤樣紅斑,為擴張的毛細血管；實驗室檢查顯示重度貧血,放大電子胃鏡檢查顯示胃底粘膜存在擴張、扭曲的毛細血管,經(jīng)窄波成像技術(shù)更清晰的顯示出擴張的胃粘膜毛細血管叢。先證者之子亦有自發(fā)性鼻衄史及毛細血管擴張表現(xiàn)。先證者及其兒子可明確診斷為HHT。先證者孫子無出血癥狀及毛細血管擴張。家系中

3、其他成員均無出血史和皮膚粘膜毛細血管擴張證據(jù),不滿足HHT診斷標準。
　　 結(jié)論：先證者及其兒子可明確診斷為HHT,該病臨床表型上具有異質(zhì)性,遺傳系譜圖提示該家系的HHT表型傳遞符合常染色體顯性遺傳規(guī)律。
　　 目的：鑒定遺傳性出血性毛細血管擴張癥(HHT)家系致病基因突變位點,探討HHT的分子診斷方法及臨床意義。
　　 方法：(1)用聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)技術(shù)擴增先證者及其家系成員外周血ACVRL1,ENG基

4、因及SMAD4基因全部編碼的外顯子序列及鄰近內(nèi)含子序列,并對PCR產(chǎn)物進行正反雙向測序,確定上述基因是否存在突變位點；(2)在發(fā)現(xiàn)先證者及其兒子,孫子存在ACVRL1基因6號內(nèi)含子772+27 G>C核苷酸替代后,因該替代破壞了一個StuI限制性內(nèi)切酶酶切位點,對先證者及其家系成員、93例正常對照PCR擴增片段進行StuI限制性內(nèi)切酶圖譜分析,同時對20例正常人該區(qū)域PCR產(chǎn)物行測序分析。
　　 結(jié)果：(1)在ACVRL1基因6

5、號內(nèi)含子區(qū)域,先證者、先證者之子、先證者之孫均存在772+27 G>C突變,而無任何臨床表型的先證者丈夫及兒媳不存在該位點核苷酸替代；在ACVRL1基因編碼區(qū)域,未發(fā)現(xiàn)有意義的核苷酸突變；在ENG基因及SMAD4基因編碼序列亦未發(fā)現(xiàn)有意義的核苷酸突變；(2).ACVRL1基因6號內(nèi)含子772+27 G>C突變在113例正常對照中的檢測均為陰性,包括93例正常人PCR產(chǎn)物的StuI限制性內(nèi)切酶圖譜分析及20例正常人PCR產(chǎn)物直接測序。說明

6、該堿基替代為“非多態(tài)性”。
　　 結(jié)論：對HHT致病相關(guān)基因的“全搜索”結(jié)果發(fā)現(xiàn),該家系受累成員存在ACVRL1基因6號內(nèi)含子772+27 G>C替代,在人群中,該替代的發(fā)生率為0/113,說明該位點的核苷酸替代為“非多態(tài)性”,可能為致病相關(guān)突變。
　　 目的：分析ACVRL1基因內(nèi)含子6突變及甲基化對ACVRL1表達水平的影響以及該突變對ENG及VEGF表達水平的影響,闡明該基因突變可能的致病機制。
　　 方法

7、：(1)用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測該家系成員與正常對照外周血單個核細胞ACVRL1,ENG及VEGF基因mRNA表達水平；(2)用Western印跡分析該家系成員以及正常人ACVRL1蛋白表達水平；(3)擴增先證者cDNA外顯子6及外顯子7全序列并測序,檢測內(nèi)含子6突變是否影響外顯子6/外顯子7剪接；(4)用Real-time PCR方法,檢測甲基化抑制劑5-氮雜胞苷干預(yù)后先證者外周血單個核細胞.ACVRL1基因mRNA表達情況；(5

8、)用凝膠電泳遷移試驗(EMSA)研究ACVRL1內(nèi)含子6突變序列對轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用。
　　 結(jié)果：(1)實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示,家系中受累成員ACVRL1 mRNA表達較正常人顯著降低,而ENG及VEGF基因mRNA表達水平較正常人顯著增高；(2)家系中受累成員ACVRL1蛋白表達較家系中非HHT患者及正常人顯著降低；(3)ACVRL1 cDNA擴增外顯子6與外顯子7相應(yīng)序列測序結(jié)果無異常,顯示772+27 G>C突變不影

9、響外顯子6/外顯子7剪接；(4)先證者單個核細胞甲基化抑制劑干預(yù)后ACVRL1 mRNA表達仍明顯下調(diào),與未干預(yù)細胞比較無顯著差異,表明突變區(qū)域核苷酸甲基化并不影響ACVRL1轉(zhuǎn)錄調(diào)控；(5)EMSA結(jié)果顯示核轉(zhuǎn)錄因子SP1可與野生型探針結(jié)合,不能與突變型探針結(jié)合,提示ACVRL16號內(nèi)含子772+27 G>C突變導(dǎo)致與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合能力下降。
　　 結(jié)論： ACVRL16號內(nèi)含子772+27 G>C突變導(dǎo)致ACVRL1基因及蛋白

10、表達下調(diào),影響與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合能力可能為該家系HHT的發(fā)病機制。
　　 目的：對1例May-Hegglin異常(MHA)先證者非肌性肌球蛋白重鏈9基因(MYH9)突變位點進行篩選,并對其無臨床及血液學(xué)表型的家系成員進行基因分析,以確定先證者MYH9基因突變與其父母該基因位點的遺傳關(guān)系。
　　 病例與方法：(1)先證者為29歲女性,因血小板計數(shù)減少、巨大血小板和中性粒細胞包涵體而診斷為May-Hegglin異常。其有血緣關(guān)系

11、的父母、兄長血小板計數(shù)均正常,外周血涂片未發(fā)現(xiàn)中性粒細胞包涵體及巨大血小板,臨床無出血傾向；(2)用透射電鏡觀察先證者外周血粒細胞包涵體；用掃描電鏡觀察其外周血巨大血小板形態(tài)；(3)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)擴增患者及其父母MYH9基因突變熱點區(qū)域,并對PCR產(chǎn)物進行正反向測序,確定其突變位點。
　　 結(jié)果：(1)先證者具有典型的“血小板減少、巨大血小板、中性粒細胞包涵體”三聯(lián)征,MHA診斷成立；而患者父母及兄長顯然為健康正常

12、者；(2)透射及掃描電鏡觀察證實先證者外周血存在巨大血小板及粒細胞包涵體；(3)先證者MYH9基因40號外顯子第5797位核苷酸存在C>T突變,該突變導(dǎo)致編碼的非肌性肌球蛋白重鏈ⅡA(NMMHC-ⅡA)蛋白第1933位精氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榻K止密碼子(R1933X)；先證者MYH9基因33號外顯子存在4876A>G雜合突變；先證者父母均未檢測出R1933X突變,其母不存在4876A>G多態(tài)性,其父為4876A>G多態(tài)性的純合子。
　　 結(jié)