遺傳性出血性疾病的臨床特點(diǎn)和分子致病機(jī)理研究.pdf

1、隨著分子生物學(xué)進(jìn)展特別是人類基因組研究的發(fā)展，越來越多的遺傳性出血性疾病的分子機(jī)制被闡明，這對(duì)于深入探討血小板的病理生理意義以及結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系具有重要的意義。基因診斷也成為今后遺傳性出血性疾病研究的發(fā)展的主要方向。巨大血小板綜合征（Bernard-Soulier syndrome，BSS)是一種罕見的先天性遺傳性血小板疾病，主要是由于血小板膜糖蛋白GPIb和GPIX質(zhì)或量的缺陷所致。以出血時(shí)間延長(zhǎng)、血小板數(shù)量減少、血小板體積巨大為特征

2、。血小板無力癥(Glanzmann thrombasthenia,GT)是以血小板膜上整合素α IIbβ3的質(zhì)和(或)量的缺陷為特征的一種常染色體隱性遺傳性疾病，表現(xiàn)為血小板對(duì)多種生理性誘聚劑反應(yīng)低下或缺如。先證者通常是因?yàn)樽杂子胁荒芙忉尩某鲅獌A向而就診，這些出血程度表現(xiàn)各異，常被漏診或誤診,因此，詳盡的臨床檢查和基因檢測(cè)是正確診療的前提。
　　在我們的臨床研究中，對(duì)上述13例先證者進(jìn)行表型診斷、基因分析、功能檢測(cè)和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，

3、以探究其分子發(fā)病機(jī)制。用血小板聚集儀檢測(cè)所有先證者不同誘導(dǎo)劑的血小板聚集率；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)患者血小板的GPIbα、GPIbβ、GPIX、GPIIb、GPIIIa的陽性百分率和熒光強(qiáng)度;提取先證者及其家系成員外周血DNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增GPIbα、GPIbβ、GPIX、GPⅡb和GPIIIa五種基因全長(zhǎng)編碼序列，PCR產(chǎn)物直接進(jìn)行DNA測(cè)序分析；構(gòu)建突變型質(zhì)粒,用含有野生型或突變型全長(zhǎng)編碼序列的質(zhì)粒對(duì)中國(guó)倉鼠卵巢（CHO）細(xì)胞共轉(zhuǎn)染；流式

4、細(xì)胞術(shù)檢測(cè)患者共轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞的GPIbα、GPIbβ、GPIX、GPIIb與 GPIIIa陽性百分率和熒光強(qiáng)度；應(yīng)用免疫印跡分析轉(zhuǎn)染后CHO細(xì)胞胞漿中GPIb-GPIX復(fù)合物GPIIbIIIa復(fù)合物的表達(dá)；進(jìn)行PCR擴(kuò)增FLNA基因；免疫熒光法檢測(cè) FLNA在血小板鋪展過程中的表達(dá)及分布；Western blot檢測(cè)FLNA、Sky與Syk-P在靜息狀態(tài)下血小板聚集過程中的表達(dá)。
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3例 BSS先證者中，血小板對(duì)瑞斯

5、托霉素誘導(dǎo)的聚集顯著降低（范圍，0％-3.5%；平均值1.2%），其中先證者2對(duì)低濃度膠原誘導(dǎo)的血小板聚集率明顯減少；流式檢測(cè)顯示血小板表面膜糖蛋白GPIbα表達(dá)量嚴(yán)重降低（范圍,0.5%-7.1%；平均值,3.2%）；10例GT先證者中，血小板對(duì)ADP誘導(dǎo)的聚集反應(yīng)明顯低下，部分缺失(范圍,0%-20.9%，平均值6.1%)；流式檢測(cè)顯示血小板表面膜糖蛋白GPIIbIIIa復(fù)合物的表達(dá)量嚴(yán)重下降：GPIIb（范圍，0.1%-98.7%

6、；平均值,19.6%），GPIIIa（范圍，0.3%-100%；平均值56.1%）。其中1例GT先證者GPIIbIIIa表達(dá)大于50％，然而，血小板與纖維蛋白原的結(jié)合能力明顯低下，相當(dāng)于正常對(duì)照的14%。
　　通過基因測(cè)序，我們共發(fā)現(xiàn)有15種突變，其中錯(cuò)義突變8種、無義突變2種和剪切子突變5種。15種突變中，1種突變發(fā)生FLNA基因，2種突變發(fā)生在IBA基因，2種突變發(fā)生在β3基因,10種突變發(fā)生在α II b基因。我們對(duì)其中的G

7、PIbα基因987 G>A，GPIbα基因1480 delA和GPIIIa719G>A進(jìn)行了CHO細(xì)胞共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn),瞬時(shí)轉(zhuǎn)染突變型GPIbα987 G>A質(zhì)粒的CHO細(xì)胞膜上GPIbα表達(dá)顯著減少但在CHO細(xì)胞胞漿中發(fā)現(xiàn)豐富的截短蛋白；瞬時(shí)轉(zhuǎn)染突變型GPIbα1480 delA質(zhì)粒的CHO細(xì)胞膜上未見GPIbα的表達(dá)，但GPIX在CHO細(xì)胞胞膜上的表達(dá)率為陽性對(duì)照的18%；穩(wěn)定轉(zhuǎn)染突變型GPIIIa719G>A質(zhì)粒的CHO細(xì)胞膜上GPII