部分遺傳性出血性疾病的分子發(fā)病機制研究及凝血酶生成試驗的應用.pdf

1、遺傳性凝血因子X缺陷癥是一種罕見的出血性疾病，有研究表明患者血漿中的凝血因子X活性（FX:C）與其臨床癥狀間的相關性較弱。凝血酶生成試驗可從整體水平評估個體出血傾向的試驗。本研究對四例遺傳性凝血因子X缺陷癥家系進行了完整的表型診斷及基因診斷，同時檢測了四條途徑激活的FX:C及FX的抗原水平（FX:Ag）。采用標準化的操作流程分別檢測凝血因子X缺陷癥患者血漿在1 pM組織因子及5 pM組織因子激活下的凝血酶生成能力，并研究玉米胰蛋白酶抑制

2、劑（corn trypsin inhib itor，CTI）在抑制體外接觸激活后對兩種組織因子濃度激活下的凝血酶生成的影響。先證者3屬于Ⅲ型FX缺陷，其基于各途徑的FX:C分別為6.2％、1.2%、1.0%和13.6%，其余三例先證者均為Ⅰ型F X缺陷。結果表明，無論對于正常人血漿標本還是凝血因子X缺陷癥患者血漿標本，凝血酶生成試驗在1 pM組織因子激活時需要加入CTI以消除體外接觸激活對標本凝血酶生成測定的影響，在5 pM組織因子激活

3、時體外接觸激活對凝血酶生成試驗的影響則并不顯著。1 pM組織因子激活下的凝血酶生成潛力（ETP）、峰值（Peak）及凝血酶生成速率（Rate）等指標與凝血因子X缺陷癥患者血漿FX:C水平及臨床表型嚴重程度均存在良好的相關性且比5 pM組織因子激活時更敏感。因此，我們推薦使用接觸激活抑制劑（CTI），采用1 pM組織因子激活的凝血酶生成試驗以評估凝血因子X缺陷癥患者出血傾向。
　　血友病A（haemophilia A，HA）為臨床上

4、最常見的遺傳性出血性疾病，本研究對6例剪切位點相關突變HA患者進行了表型診斷和基因診斷，并明確了其分子發(fā)病機制。通過剪切位點分析軟件NNS plic e（www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html）以及Alamut2.3預測突變對mRNA剪接的影響。同時進行體內(nèi)外周血mRNA水平異位轉(zhuǎn)錄檢測患者F8基因mR NA轉(zhuǎn)錄水平，并構建小基因體外轉(zhuǎn)染293T細胞以研究6種剪切位點突變的分子發(fā)病機制并評估軟件預測

5、結果的準確性。先證者1、2、3體內(nèi)異位轉(zhuǎn)錄均檢測到兩種異常轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，先證者4、5、6只檢測到了1種異常轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。先證者1突變（c.599_601+2delAAGGT）導致了4號外顯子及4、5號外顯子的聯(lián)合缺失。先證者2為c.1444-8_1444d elAC T T T C AG A突變，其中一種異常轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物缺失了10號外顯子，另外，野生型剪切位點下游12個堿基處（c.1456）產(chǎn)生了新的剪切位點。先證者3為c.1903+5G>A突變，

6、其中一種異常轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物缺少了10號、11號、12號、13號4個外顯子序列，同時，在野生型剪切位點下游86 bp處產(chǎn)生了新的剪切位點。先證者4（c.5586+3A>T）、5（c.6115+1G>A）、6（c.6187+1delG）的突變則分別導致了F8基因16號、19號、20號外顯子的丟失。本研究中6種剪切位點相關突變的致病性與軟件預測的結果相符，但對于候選剪切位點的預測，軟件分析的結果卻不一定可靠。3種小基因體外表達的結果與先證者4、5、

7、6體內(nèi)異位轉(zhuǎn)錄結果完全一致。本研究從mRNA水平明確了6例剪切位點相關突變的分子發(fā)病機制，軟件分析及小基因體外表達的方法是預測剪切位點相關突變致病性較好的輔助手段。
　　經(jīng)統(tǒng)計，在本院近四年所檢測的343個HA家系中，發(fā)生于F8基因14號外顯子p o ly A區(qū)的缺失或插入A突變共32例，占總HA家系的9.33%，占小片段缺失或插入突變的42.11%，為HA熱點突變。這些家系中多數(shù)為散發(fā)（21例），無血友病家族史，其中又有10名先