部分遺傳性出凝血和溶血性疾病的基因診斷和分子發(fā)病機制研究.pdf

1、遺傳性易栓癥是由于抗凝活性或纖溶活性缺陷而容易發(fā)生血栓形成的一類疾病，發(fā)病較早，臨床表現(xiàn)主要以靜脈血栓為主，也可以發(fā)生動脈血栓，血栓形成可以自發(fā)或誘發(fā)。
　　本研究對1例遺傳性抗凝血酶（AT）缺陷癥患者，4例蛋白C（PC）缺陷癥患者及1例蛋白S（PS）缺陷癥患者及其部分家系成員進行了表型診斷、家系調(diào)查、基因分析和血栓相關(guān)風(fēng)險因素分析研究。6例患者均患靜脈血栓。其中，AT缺陷癥患者及其父親 AT活性分別為50％和60%，AT抗原分別

2、為133mg/L和123mg/L。TGT顯示AT缺陷癥患者凝血酶生成潛力（ETP）和凝血酶生成峰值均增高，還存在高FⅧ:C（155.8%）、低葉酸2.22ng/ml、高Hcy（22.55μmol/L）和抗β2GPI抗體增高（33.9RU/ml），LA弱陽性等易栓風(fēng)險因素。AT缺陷癥患者發(fā)生了AT基因1號外顯子g.610G>T導(dǎo)致p.Y-31X無義突變，存在FV R485K，F(xiàn)GG C10034T和MTHFR C677T雜合基因多態(tài)性。P

3、C缺陷癥患者其PC活性分別為38%、35%、49%、47%，其PC抗原分別為34%、32%、43%、45%。患者2發(fā)生了PROC基因4號外顯子 g.7962T>C突變導(dǎo)致的 p.R15W錯義突變和6號外顯子g.12695T>C突變導(dǎo)致的p.R147W錯義突變的復(fù)合雜合突變，患者3和5均攜帶8號外顯子g.15151T>C突變導(dǎo)致的p.T295I錯義突變，患者4發(fā)生了6號外顯子g.12695T>C突變導(dǎo)致的p.R147W錯義突變。除此之外，

4、患者2還有FⅤ R485K和MTHFR C677T雜合基因多態(tài)性?；颊?有FⅤ R485K，F(xiàn)GG C10034T和MTHFR C677T純合基因多態(tài)性，患者4為FⅤR485K，F(xiàn)GG C10034T純合及MTHFR C677T雜合基因多態(tài)性?；颊?有FⅤ R485K雜合、MTHFR C677T雜合及FGG C10034T純合基因多態(tài)性。PS缺陷癥患者6，PS活性為45%，其PROS1基因4號外顯子發(fā)生了g.68394T>C突變導(dǎo)致的p

5、.R49C錯義突變，并有FGG C10034T純合及MTHFR C677T，C.2698C/A雜合基因多態(tài)性。通過患者及其家系成員情況的比較，抗凝蛋白基因缺陷是導(dǎo)致患者血栓發(fā)生的重要因素，而血栓相關(guān)基因多態(tài)性的存在及部分血栓風(fēng)險因素指標陽性大大增加了易栓癥的血栓發(fā)生風(fēng)險。
　　凝血因子Ⅺ（FⅪ）缺陷又被稱為血友病 C，其發(fā)病率較低，在人群中約為1/(100000~1000000)，猶太人后裔中發(fā)病率較高，為常染色體隱性遺傳病。臨床

6、常無出血表現(xiàn)。
　　本研究針對近年來就診的21例 FⅪ缺陷病人，進行了表型診斷和基因分析，在21例病人中，有3例曾有過臨床癥狀，兩例有輕微的鼻出血和月經(jīng)過多史，就診時無癥狀。一例有過連續(xù)三天半夜鼻出血超過500ml的病史，就診時仍然有瘀斑。1例曾有腹部外科手術(shù)后出血不止病史。其余17例病人均為術(shù)前檢查或體檢中查出，平時無任何臨床出血癥狀。血漿中FⅪ檢測顯示，19例病人為FⅪ重型缺陷，2例為FⅪ輕型缺陷。21例病人中有5例為純合突變

7、，12例為復(fù)合雜合突變，4例為雜合子。為明確中國人群中FⅪ突變特點，將本實驗室前期發(fā)表的18例FⅪ突變一并探討。39例病人中共檢測出28種不同的基因突變，包括14種錯義突變，6種無義突變，6種剪切位點突變及2種小缺失突變。突變大多集中在外顯子7、8和11-13中。W228X（p.W246X）、G400V（p.G418V）、c.1136-4delGTTG及 Q263X（p.Q281X）突變發(fā)生占了將近77%（30例），在這四種突變中，W2

8、28X（p.W246X）和c.1136-4delGTTG兩種突變目前僅在中國人群中有發(fā)現(xiàn)。兩例病人進行了TEG診斷，雖然病人臨床無出血癥狀，但TEG結(jié)果仍然提示其整體凝血功能低下，有出血傾向。用 TEG對一例曾有過術(shù)后出血史的病人進行圍手術(shù)期治療監(jiān)測，在病人進行術(shù)前治療輸注冰凍血漿過程中，TEG結(jié)果也顯示了其體內(nèi)凝血功能逐漸恢復(fù)至正常，保證了手術(shù)順利進行及術(shù)后順利恢復(fù)。證實了TEG在癥狀不明顯的出凝血功能評估方面的實用性。
　　遺

9、傳性球形紅細胞增多癥是一種紅細胞膜蛋白異常而導(dǎo)致的溶血性黃疸疾病，臨床主要表現(xiàn)為間歇性黃疸，不同程度的貧血，脾大等。其外周血涂片可以看到相當比例的球形紅細胞。
　　本研究對3例遺傳性球形紅細胞增多癥患者進行了表型診斷，家系調(diào)查，基因分析及分子發(fā)病機制研究。三例患者外周血涂片都顯示球形紅細胞比例增高，在排除了其它類型的溶血性貧血的同時進行了孵育紅細胞滲透脆性試驗，高滲冷溶血試驗，酸化甘油溶血試驗及EMA結(jié)合試驗進行明確。對其外周血紅

10、細胞采用SDS-PAGE電泳進行了紅細胞膜蛋白分析，發(fā)現(xiàn)病人的紅細胞膜相關(guān)缺陷蛋白后，進行了相關(guān)基因檢測。三例患者的診斷試驗都顯示出明顯的紅細胞脆性增加，容易破裂。紅細胞膜蛋白分析發(fā)現(xiàn)患者1為錨蛋白缺陷，編碼基因為ANK1，患者2和患者3為β血影蛋白缺陷，編碼基因為SPTB。病例1 ANK118號外顯子和內(nèi)含子發(fā)生雜合缺失，使得編碼錨蛋白的第192981_192986delACAAGG堿基缺失，其中“ACAAG”位于18號外顯子，“G”

11、屬于18號內(nèi)含子。其剪接位點分析中，熒光實時定量PCR顯示有3種異常轉(zhuǎn)錄方式，一種剪接方式為部分16號外顯子與部分19號外顯子連接，一種為18號外顯子缺失，還有一種推測為17和18號外顯子被剔除。根據(jù)實時定量PCR檢測正常剪接與這三種異常剪接方式所占的比例分別為：53.64%，25.33%，17.64%，3.39%。病例2在SPTB第13號外顯子發(fā)生g.35075G>A雜合突變，使編碼色氨酸的863位密碼子TGG突變?yōu)榻K止密碼子，即p.