遺傳性疾病的分子診斷

1、遺傳性疾病的分子診斷,上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院 樊綺詩教授,——診斷策略和工具,用分子生物學(xué)技術(shù)通過檢測基因而達到診斷疾病的目的是生物學(xué)者在分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展的最初階段就有的設(shè)想。1976年人們開始在實驗室進行研究，1984年以來，基因檢測在許多國家已成為常規(guī)項目，主要用于遺傳性疾病的診斷。,一、遺傳性疾病的分類,常染色體連鎖遺傳性疾病 ——致病基因位于常染色體性染色體連鎖遺傳性疾病

2、 ——致病基因位于性染色體,常染色體連鎖遺傳性疾病,常染色體隱性遺傳——位于一對常染色體上的兩個等位基因均發(fā)生突變才能產(chǎn)生臨床癥狀，此時所導(dǎo)致的相應(yīng)疾病即為常染色體連鎖隱性遺傳性疾病。同一對染色體中只有一個等位基因發(fā)生突變的個體稱為雜合子，二個等位基因均發(fā)生突變的個體稱為純合子。囊性纖維變：常染色體連鎖隱性遺傳(7q31),,常染色體連鎖顯性遺傳——位于一對常染色體上的二個等位基因之一發(fā)生突變即產(chǎn)生臨

3、床癥狀，所導(dǎo)致的相應(yīng)疾病即為常染色體連鎖顯性遺傳性疾病。特點：家系中患者數(shù)目較多，大多情況下每一代均有患者。Huntington舞蹈癥：常染色體顯性遺傳(4p16.3),性染色體連鎖遺傳性疾病,X染色體連鎖遺傳：大多為隱性 (如甲型血友病、杜氏肌營養(yǎng)不良癥)，顯性遺傳非常罕見。Y染色體連鎖遺傳,二、遺傳性疾病中常見的分子異常,遺傳性疾病的產(chǎn)生是由于一個（或數(shù)個）基因發(fā)生異常導(dǎo)致這些基因所載有的遺傳信息受到改變，而發(fā)病是通過遺傳

4、物質(zhì)的表達產(chǎn)物——蛋白質(zhì)（或酶）的表現(xiàn)異常所致?；蛲蛔冎饕ㄈ箢?，即點突變、片段性突變和動態(tài)性突變。,（一）點突變,點突變：DNA分子中單個堿基的替換終止密碼子突變：點突變導(dǎo)致提前產(chǎn)生終止密碼，或終止密碼突變而編碼一個氨基酸使肽鏈延長。錯義突變、無義突變、移碼突變,,,各種點突變所造成的后果：蛋白質(zhì)分子量改變、蛋白質(zhì)合成量下降、無蛋白質(zhì)合成。,（二）片段性突變,核苷酸的丟失和增多缺失：基因中鹼基（遺傳物質(zhì)）的丟失插入

5、：外來基因片段插入某一基因序列中倍增：基因內(nèi)部某一段序列發(fā)生重復(fù)基因重排：基因組中原來不在一起的基因 由于某些原因組合排列在一起。,（三）動態(tài)性突變,以三核苷酸為單位的重復(fù)序列，在傳遞過程中不穩(wěn)定，會發(fā)生擴展，即子代的重復(fù)次數(shù)往往較親代大為增加，因此又稱動態(tài)性突變。 脆性X綜合征：CGG重復(fù) 少年脊髓型共濟失調(diào)：GAA重復(fù) ……,三、遺傳性疾病基因診斷的策略,（一）直接診斷策略 基因診斷的直接策

6、略就是通過各種分子生物學(xué)技術(shù)檢測基因的遺傳缺陷，因此直接診斷的前提是被檢測基因的正常序列和結(jié)構(gòu)必須被闡明。 直接診斷由于是直接揭示遺傳缺陷，因而比較可靠。,,（二）間接診斷策略,間接診斷的實質(zhì)是在家系中進行連鎖分析，通過分析可確定個體來自雙親的同源染色體中的哪一條為致病染色體，從而判斷該個體是否帶有致病基因。 間接診斷不是尋找 DNA 的遺傳缺陷，而是通過分析DNA的遺傳標(biāo)記的多態(tài)性估計被檢者患病的可能性。,,四

7、、基因診斷所采用的技術(shù),(一) 直接診斷所采用的技術(shù),DNA片段性突變的檢測 （1）Southern 印跡技術(shù) 將基因組DNA用限制性酶水解成無數(shù)片段經(jīng)凝膠電泳后用堿處理使凝膠中的DNA變性為單鏈，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜或尼龍膜上，用標(biāo)記探針與變性單鏈雜交，可使特異條帶顯影。,（2）多重PCR技術(shù),在一個PCR反應(yīng)體系中放入多對引物，當(dāng)基因的外顯子發(fā)生缺失時，根據(jù)條帶缺失的數(shù)目和引物相應(yīng)的位置，可判斷基因中哪一

8、個或哪幾個擴增部位發(fā)生缺失。,2. 點突變,（1） 已知點突變的檢測方法 a）PCR-RFLP 利用正常序列或突變序列是否處于限制性內(nèi)切酶的酶切位點而設(shè)計。若點突變處于某一限制性內(nèi)切酶的酶切位點內(nèi)，可在突變點兩側(cè)設(shè)計引物，使PCR產(chǎn)物含有該突變序列。用相應(yīng)的內(nèi)切酶對正常產(chǎn)物和突變產(chǎn)物進行水解并作電泳分離，可根據(jù)水解片段的大小和電泳位置區(qū)分二者。,b）等位基因特異性寡核苷酸雜交,被檢基因經(jīng)PCR擴增后轉(zhuǎn)移到膜上

9、，分別與長度為15~20bp、經(jīng)標(biāo)記的正常序列和突變序列的寡核苷酸探針雜交。由于20個堿基中僅一個堿基差異即可使DNA分子的Tm值下降 5~7.5℃，因此通過嚴(yán)格控制雜交條件，可使PCR產(chǎn)物僅與完全互補的探針雜交，根據(jù)有無雜交信號即可判斷被檢者的擴增片段中是否帶有突變點。,C）PCR-ELISA,將PCR產(chǎn)物用ELISA方法加以檢測的技術(shù)。在對目的基因擴增時，dNTP中同時混有用生物素標(biāo)記的Bio-16-dUTP，使擴增產(chǎn)物帶有生物素標(biāo)

10、記。若該產(chǎn)物能與突變點特異的寡核苷酸探針（3’端地高辛11-DIG-ddUTP標(biāo)記）雜交，則該產(chǎn)物便帶有地高辛標(biāo)記信號，可利用與抗地高辛抗體共價結(jié)合的酶標(biāo)檢測系統(tǒng)進行顯色反應(yīng)，從而判斷突變的存在。,d）寡核苷酸連接檢測（oligonucleotide ligation assay，OLA）,——設(shè)計2個探針（探針A和B），探針A、B分別位于被檢片段的5’和3’端，探針A的3’端與探針B的5’端緊鄰，A探針的5’端和B探針的3’端分別用生

11、物素和地高辛標(biāo)記。設(shè)計引物時使突變位點位于A探針的3’末端處。被檢標(biāo)本經(jīng)PCR反應(yīng)后，使產(chǎn)物變性，同時與兩個探針雜交，根據(jù)ELISA顯色反應(yīng)檢測有無連接產(chǎn)物的形成即可知PCR產(chǎn)物中是否含有突變點。,e）DNA芯片技術(shù)（DNA chip）,在固相支持物(硅片、玻璃、聚丙烯或尼龍膜等）表面有序地陣列一系列固定于一定位置的分子（探針），當(dāng)標(biāo)記樣品（如用化學(xué)熒光法、化學(xué)發(fā)光法標(biāo)記）與探針進行雜交后，用共聚焦熒光自動掃描等技術(shù)獲取信息，經(jīng)計算機系

12、統(tǒng)處理、分析后得到結(jié)果。,,目前主要有2種類型：基片上就位合成寡核苷酸點陣芯片(ONA）和微量點樣技術(shù)制作cDNA點陣芯片（CDA）。,（2）未知點突變的檢測方法,a) 單鏈構(gòu)象多態(tài)性（single-strand conformational polymorphism，SSCP） 突變DNA的PCR產(chǎn)物經(jīng)變性后產(chǎn)生兩條與正常 DNA構(gòu)象不同的單鏈，在非變性聚丙烯酰胺凝膠電 泳時，不同構(gòu)象的片段顯示不同的電泳遷

13、移率，從 而能區(qū)別正常與突變的DNA。SSCP只適用于檢測 150~200bp長度的DNA片段。 不同順序 不同構(gòu)象 不同電泳行為,,,b) 變性梯度凝膠電泳（DGGE）,利用不同序列的DNA分子具有不同的融點溫度(Tm)的特性。設(shè)計引物時使被擴增的目的片段含有2個不同的區(qū)域，一個Tm較高，另一個較低，將該PCR產(chǎn)物在由變性劑形成的梯度凝膠上進行電泳，由于正常

14、序列的PCR產(chǎn)物與突變的 PCR 產(chǎn)物的Tm不同，在電泳過程中Tm較低的區(qū)域被部分解鏈的先后不同，造成電泳遷移率的變化也不同，最后在凝膠中所處的電泳位置也不同，據(jù)此可以區(qū)別正常片段與突變片段。,c)異源雙鏈分析（heteroduplex analysis，HA）,正常DNA和突變DNA在一起變性后再緩慢復(fù)性，可使兩者互補形成異源雜合雙鏈，并在錯配處形成一個凸起。在非變性凝膠電泳時，異源雙鏈片段會產(chǎn)生與相應(yīng)的同源雙鏈片段不同的遷移率，從

15、而使二者分開。,d) 熔點曲線分析(melting curve analysis）,DNA片段中突變堿基與正常堿基不能配對而形成異源雙鏈，所產(chǎn)生的Tm較完全配對的同源雙鏈的Tm低，在儀器上顯示出不同的曲線從而將突變序列檢測出來。所需儀器如高效液相色譜儀(DHPLC)、WAVE DNA片段分析系統(tǒng)、LightCycler等。,e)雙脫氧指紋圖譜（dideoxy fingerprinting，ddF）,是將SSCP和Sanger

16、雙脫氧測序法結(jié)合起來的一種突變檢測方法。將PCR產(chǎn)物純化后用與 2 條雙鏈各自互補的兩個引物分別做sanger測序反應(yīng)，但不同的是僅加入一種雙脫氧核苷，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，根據(jù)突變性質(zhì)電泳圖譜上會顯示丟失或獲得一條帶或者至少有一條帶的遷移率會發(fā)生改變。,f.DNA序列分析（DNA sequencing）,Sanger測序技術(shù)： 以待測序列的單鏈DNA作為模板，加入一個引物和dNTP作為底物，并加入一定比例的2’，3’-d

17、dNTP，在DNA聚合酶的作用過程中，正常dNTP的摻入使鏈延伸，若ddNTP的摻入則使鏈終止，這樣就可以得到一系列長度不同的以四種ddNTP結(jié)尾的DNA片段，經(jīng)電泳后可直接讀出堿基序列。,g)蛋白截短測試驗（protein truncation test，PTT）,從蛋白質(zhì)水平檢測由于堿基突變導(dǎo)致終止密碼產(chǎn)生而使蛋白質(zhì)合成提前終止產(chǎn)生截短的蛋白質(zhì)。將正常人和病人的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并以cDNA作為模板進行PCR反應(yīng)，擴增產(chǎn)物在

18、體外經(jīng)過轉(zhuǎn)錄，在無細胞提取液中能被翻譯而合成蛋白質(zhì)。所合成的蛋白質(zhì)經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測時會出現(xiàn)比正常蛋白質(zhì)截短的蛋白質(zhì)。,3. 動態(tài)突變的檢測,PCR技術(shù) Southern印跡技術(shù),,4.基因表達異常的檢測,定量PCR技術(shù) 1. DNA結(jié)合染料技術(shù) 2. 水解探針技術(shù)(又稱TaqMan probe)技術(shù) 3. 雜交探針技術(shù)(又稱熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù) (fluorescence resonance

19、 energy transfer, FRET),（二）間接診斷所采用的技術(shù),1. 雙等位基因多態(tài)性限制性片段長度多態(tài)性（RFLP） 第一代DNA的遺傳標(biāo)記，具雙等位基因（bi-allele）多態(tài)性，所含信息量有限。 檢測方法：Southern印跡技術(shù),2. 多等位基因多態(tài)性,小衛(wèi)星序列　　　又稱串聯(lián)重復(fù)可變數(shù)目（variable number tandem

20、repeats，VNTR), 第二代DNA的遺傳標(biāo)記，以6 ~70bp為單位，可重復(fù)數(shù)次至數(shù)十次，以串聯(lián)形式排列，構(gòu)成數(shù)量可變的串聯(lián)重復(fù)序列。等位基因常常達10 個以上，信息量比RFLP大得多。 檢測方法：Southern印跡或PCR技術(shù),,微衛(wèi)星序列 (microsatellite) 以2~6bp為單位，重復(fù)次數(shù)可達幾十次，又稱短串聯(lián)重復(fù)序列(STR) 。在基因組中出現(xiàn)的數(shù)目和頻率不同，分布廣泛，具高度多態(tài)性

21、。,3. 單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）,第三代DNA的遺傳標(biāo)記，其多態(tài)性僅表現(xiàn)為單個核苷酸的變異。在人類基因組中的數(shù)目可達300萬個，是一種信息量非常大的標(biāo)記系統(tǒng)。 　　檢測方法：DNA芯片技術(shù),,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,C50: C49:

22、 C45: C44: Cjp:,11223,C50: C49: C45: C44: Cjp:,12212,21313,C50: C49: C45: C44: Cjp:,21121,21313,C50: C49: C45: C44: Cjp:,21121,21313,C50: C49: C45:

23、 C44: Cjp:,21121,12212,C50: C49: C45: C44: Cjp:,,12212,C50: C49: C45: C44: Cjp:,21313,C50: C49: C45: C44: Cjp:,11223,12212,C50: C49: C45: C44:

24、 Cjp:,21313,C50: C49: C45: C44: Cjp:,21313,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,,,,1,2,,,,,,,,,,,,,,,5.8 5.8 2.8 3.4 4.5

25、 4.5 0.9 0.9 0.9 N N N 4.8 4.8 4.8 5 5 5,5.8 5.8 2.8 5.8 4.5 3.4 4.5 4.5

26、 0.9 0.9 0.9 0.9 N N N N 4.8 4.8 4.8 4.8 5 5 5 5,1 2

27、3 4,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,5.8 2.8 4.8 4.8 1.2 0.9 inv N 5 5,,,,,,,,,,,,2.84.80.9 - 5,2.84.80.9 - 5,,5.8 4.8 1.2 inv 5,5.8 4.8 0.9 N 5,5.8

28、 4.8 1.2 inv 5,5.8 4.8 0.9 N 5,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,,,,（三）間接診斷的不確定性,遺傳標(biāo)記所帶的信息性有限新突變基因重組家系成員不夠完整,五、基因檢測的標(biāo)本制備,DNA或RNA　來自外周血、體液、分泌物和組織如毛發(fā)、皮膚、肌肉、器官、腫瘤組織等,,產(chǎn)前基因診斷標(biāo)本：　羊水細胞（16~20周）　絨毛膜細胞（8~12周）非創(chuàng)傷性