2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、分子診斷的臨床應(yīng)用,上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院樊綺詩 教授,用分子生物學(xué)技術(shù)通過檢測基因而達(dá)到診斷疾病的目的是生物學(xué)者在分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展的最初階段就有的設(shè)想。 上世紀(jì)70年代人們開始在實驗室進(jìn)行研究,80年代以來,基因檢測在許多國家已成為常規(guī)檢驗項目,主要用于感染性和遺傳性疾病等的診斷。,,1953年Watson 和Crick 提出脫氧核糖核酸的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型。1990年人類基因組計劃正式啟動。2001年2月科學(xué)家宣布完成人類基

2、因組的全部序列圖。,DNA重組技術(shù)(DNA recombination) 轉(zhuǎn)基因技術(shù)(transgenic technique) 基因組學(xué)(genomics) 蛋白組學(xué)(proteomics) 基因治療(genotherapy) 生物芯片(biochip)等技術(shù) 已應(yīng)用到醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,對疾病機(jī)理的認(rèn)識、疾病的診斷、預(yù)防和治療產(chǎn)生了深刻的影響。,分子診斷不僅能早期對疾病作出確切的診 斷

3、,也能確定個體對疾病的易感性,判別 致病基因攜帶者并對疾病的分期、分型、 療效監(jiān)測和預(yù)后作出判斷。分子診斷已成為實驗診斷學(xué)的一個重要組 成部分,成為一門新的學(xué)科。Molecular diagnosis Molecular diagnostics,,一、基因檢測在感染性疾病中的應(yīng)用,,SARS相關(guān)冠狀病毒的分子診斷,2003年4月,香港研究者Peiris等報告了50 例SARS病人的臨床表現(xiàn)和病毒學(xué)研究結(jié)果

4、。一種新的冠狀病毒 (Coronavirus) 是SARS 的致病原因。 (Lancet, 2003, 361: 9365),2003年4月,德國漢堡Bernhard-Nocht熱帶醫(yī)學(xué)研究所學(xué)者Drosten等用隨機(jī)擴(kuò)增技術(shù),獲得一段長度為300bp的核苷酸序列。根據(jù)這段序列,建立了檢測新冠狀病毒的常規(guī)和實時定量PCR技術(shù)。

5、 www.nejm.com.org on April 10, 2003),檢測標(biāo)本 痰液、咽拭子、鼻拭子、支氣管肺泡灌洗液 、血漿、糞便。檢測方法 1. 逆轉(zhuǎn)錄-巢式PCR (Reverse-Nested PCR) 2. 逆轉(zhuǎn)錄-實時PCR (Reverse-Real time PCR),有報道顯示,在可能SARS病人中病毒的檢出率為100%。在疑似SARS病人中的檢出率為23%。所有健康接觸者中

6、未檢測到病毒。,另一項研究顯示 檢測病毒的3種方法(血清學(xué)檢測、病毒分離、PCR技術(shù))中,PCR技術(shù)的檢出率最高。,討 論,疾病的早期即可獲得陽性結(jié)果(早于血清轉(zhuǎn)換期)。SARS患者中的陽性率約為80%,對照中的陰性率約為98%~100%?,F(xiàn)有的PCR方法有較高的特異性但靈敏度較差,陰性結(jié)果不能排除病毒感染。,討 論,痰液中病毒RNA濃度極高,說明病毒從呼吸道排放是主要傳播途徑。血清中檢測到極低濃度的病毒RNA,提示

7、病毒復(fù)制不僅發(fā)生于呼吸道。病人恢復(fù)晚期的糞便中存在病毒RNA,說明糞便可能也是一種傳播途徑。鼻、咽拭子中含有的病毒RNA顯著少于痰液,提示不適合作為標(biāo)本(有可能漏檢)。,SARS相關(guān)冠狀病毒基因檢測必須注意的問題,必須在規(guī)范的基因擴(kuò)增實驗室中進(jìn)行。應(yīng)采取必要的質(zhì)控規(guī)程,包括陽性對照和陰性對照。陽性結(jié)果時必須對原始樣本重復(fù)檢驗: 或者擴(kuò)增另一個基因片段 或在另一個實驗室對同一樣本進(jìn)行檢測。,肝炎病毒基因的檢測,臨

8、床價值主要體現(xiàn)在:病情評估 血清中病毒含量的多少與肝臟病理損害程度相關(guān),病毒載量越高,肝組織炎癥反應(yīng)程度越重。療效預(yù)測 治療前病毒核酸載量越高,療效越差;載量越低,機(jī)體清除病毒的可能性越大。,,預(yù)后判斷病毒核酸載量持續(xù)處于高濃度者預(yù)后不良。垂直傳播途徑感染者,預(yù)后較差。反映肝細(xì)胞損害的其它指標(biāo)正常,但病毒核酸 水平經(jīng)常波動者更易發(fā)展為肝硬化。,,病毒分型和耐藥檢測各個編碼區(qū)段存在著大量有意義的自然變異或藥物誘導(dǎo)的

9、變異,并由此產(chǎn)生不同的變異株,從而導(dǎo)致 HBV感染的不同血清學(xué)和臨床表現(xiàn)。檢測HBV的變異株對了解疾病機(jī)制、藥物耐受和指導(dǎo)用藥有一定的價值。,HPV基因的檢測在預(yù)防宮頸癌中的作用,,,宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤之一,發(fā)病率在女性惡性腫瘤中居第二位,每年約有50萬左右新發(fā)病例。我國每年有新發(fā)病例約13.15萬,占世界宮頸癌新發(fā)病例總數(shù)的26%。,,持續(xù)的人乳頭瘤病毒(human papillomavirus, HPV) 感染是引起宮頸

10、癌和癌前病變的必要因素,93.0%-99.7%的宮頸癌組織中均可檢測到HPV DNA。高危型HPV-16和HPV-18分別占宮頸癌的50%和14%。高危型HPV的持續(xù)感染可使患宮頸癌的風(fēng)險增加250倍。,,HPV DNA的檢測方法實時定量PCR (Real time PCR)核酸雜交捕獲(Hybrid CaptureⅡ,HCⅡ),,HC Ⅱ可一次檢測所有致癌的13種高危型HPV。敏感度:對CIN Ⅱ、Ⅲ和癌的檢出率為 98%。

11、陰性預(yù)期值:對高度鱗狀上皮細(xì)胞病變或更高度病變的陰性預(yù)期值99.9%,,細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果為意義不明確的非典型細(xì)胞時,HPV基因的檢測能預(yù)測受檢者患宮頸癌的風(fēng)險。細(xì)胞學(xué)檢查+HPV基因的檢測是宮頸癌前病變和宮頸癌篩查的最佳方法,成為預(yù)防宮頸癌的關(guān)鍵。,基因檢測在監(jiān)測移植物排斥中的作用,,關(guān)于多瘤病毒,人類多瘤病毒中常見的3種病毒:BK、JC、SV40。BK病毒于1971年首次從腎臟移植受體的尿液中分離出。病毒主要在宿主的細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行復(fù)

12、制。,,在美國,10歲以上的正常人群中60%~80%有BK病毒感染史。感染的病毒多潛伏于腎小管上皮細(xì)胞和尿道上皮細(xì)胞中。BK病毒重新激活大部分是由于免疫機(jī)制缺陷或大量使用免疫抑制劑后。,,腎臟移植術(shù)后大量使用免疫抑制劑,使BK病毒重新激活,大量復(fù)制。BK病毒復(fù)制進(jìn)一步發(fā)展,成為BK病毒感染的腎間質(zhì)性腎病(BKVAN)。BKVAN患者中60%~70%會發(fā)生遠(yuǎn)期的腎臟移植失敗。,,,,BK病毒感染已經(jīng)成為腎臟移植遠(yuǎn)期失敗的重要原因之

13、一。BK病毒感染越來越受到關(guān)注。,,早期無臨床癥狀,后期癥狀與腎移植排斥和藥物毒性反應(yīng)相似,易引起誤診和漏診。BK病毒感染和移植排斥治療原則相反:BK病毒感染需要降低免疫抑制劑量,而移植排斥則應(yīng)加大用量。,,因此,建立有效的BK病毒檢測和監(jiān)測體系是十分必要的。,,decoy細(xì)胞BK病毒感染的腎臟小管上皮細(xì)胞脫落至尿液。形態(tài)學(xué)檢測敏感性較好,但特異性差。細(xì)胞形態(tài)在尿液中很容易破壞。,巴氏染色的decoy細(xì)胞,未經(jīng)染色的decoy

14、 細(xì)胞,,,,,,BK病毒感染的檢測,BK病毒的檢測血、尿中BK病毒核酸定量檢測尿液中decoy細(xì)胞檢查尿沉渣涂片原位雜交組織病理學(xué)檢查(判斷腎臟間質(zhì)性腎?。?腎臟移植術(shù)后病人BK病毒檢測的研究,對象瑞金醫(yī)院腎臟移植術(shù)后2個月~3年的患者95例正常人標(biāo)本60例研究方法尿沉渣細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測血、尿中BK 病毒DNA的定量檢測,,,,,,,,,Decoy細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征:小管上皮細(xì)胞的細(xì)胞核明顯增大,多偏向一側(cè),核漿比例明顯

15、增加;細(xì)胞邊緣常常出現(xiàn)毛玻璃樣改變;胞漿有細(xì)小顆粒,較均勻,呈果凍狀;細(xì)胞核常較粗糙。,結(jié) 果,95例患者的尿沉渣形態(tài)學(xué)檢查,35例患者的尿沉渣中出現(xiàn)可疑的病毒感染腎小管上皮細(xì)胞(decoy細(xì)胞)。,,尿液中BK病毒核酸定量檢測14例尿液中檢測到BKV DNA,病毒載量為4×103~2×109/ml,平均為5.6×105/ml。發(fā)生病毒尿的中位時間為移植術(shù)后14個月。,,血漿中BK病毒核酸檢測14例病

16、毒尿中,有5例同時出現(xiàn)病毒血癥。核酸載量為2×104/ml~4.8×106/ml,平均為 4.2×104/ml。,,,陰性對照,,,6例病毒檢測陽性的核酸標(biāo)本進(jìn)行序列分析。 所測片段序列均

17、為BK病毒的核酸序列,BK病毒核酸序列,核酸序列分析,,3例患者在臨床上出現(xiàn)不明原因的發(fā)熱、白細(xì)胞降低、緩慢的肌酐升高等癥狀,有1例甚至出現(xiàn)了尿道阻塞。臨床上認(rèn)為發(fā)生BKVAN的可能性較大,給予抗病毒治療。,病例1、2,治療前:尿液和血漿病毒核酸載量在104/ml~105/ml血肌酐分別為181μmol/L和168μmol/L治療后:血漿和尿液中BK病毒已檢測不出血肌酐降為160μmol/L和129μmol/L,,病例3,治

18、療前尿液中BK病毒核酸載量為2×109拷貝/ml尿沉渣細(xì)胞中見到大量decoy細(xì)胞和炎性細(xì)胞治療后尿液中BK病毒核酸載量降至105拷貝/ml尿沉渣細(xì)胞中decoy細(xì)胞明顯減少,治療前,治療10天后,治療20天后,,,,,,,,,,,,,討 論,文獻(xiàn)報道BK病毒的復(fù)制感染率為5%~60%,本研究中發(fā)生BK病毒復(fù)制的占14.7%。35例患者中發(fā)現(xiàn)decoy細(xì)胞,僅14例被證實存在病毒核酸,提示形態(tài)學(xué)檢查特異性差。腎

19、臟移植的患者容易導(dǎo)致包括BK病毒在內(nèi)的多種病毒感染。,,因此是否存在BK病毒感染,形態(tài)學(xué)僅作為篩查實驗。病毒核酸定量可有效地動態(tài)觀察病毒核酸的復(fù)制。,,BK病毒核酸定量檢測用于檢測BK病毒是否復(fù)制為是否需要進(jìn)行病理學(xué)檢查提供依據(jù)監(jiān)測疾病和評價治療效果預(yù)防間質(zhì)性腎病,防止移植遠(yuǎn)期失敗,二、遺傳性疾病的分子診斷,,分子診斷能夠檢出家系中的致病基因攜帶者或高危個體,能夠在胎兒出生前判斷其是否為患者,因此分子診斷是降低單基因遺傳病發(fā)

20、病率的根本措施。,,單基因遺傳病是由于某一基因結(jié)構(gòu)的變化或基因表達(dá)異常而導(dǎo)致的疾病用分子生物學(xué)技術(shù)檢測致病基因的遺傳缺陷是診斷這類疾病最根本的手段,遺傳性疾病中常見的分子異常,遺傳性疾病的產(chǎn)生是由于一個(或數(shù)個)基因發(fā)生異常導(dǎo)致這些基因所載有的遺傳信息受到改變,而發(fā)病是通過遺傳物質(zhì)的表達(dá)產(chǎn)物——蛋白質(zhì)(或酶)的表現(xiàn)異常所致?;蛲蛔冎饕c突變、片段性突變和動態(tài)性突變。,點突變 (point mutation),包括錯義突變、無義

21、突變、移碼突變各種點突變所造成的后果: 蛋白質(zhì)分子量改變 蛋白質(zhì)合成量下降 無蛋白質(zhì)合成,,片段性突變(fragememtal mutation),核苷酸的丟失和增多缺失:基因中鹼基(遺傳物質(zhì))的丟失插入:外來基因片段插入某一基因序列中倍增:基因內(nèi)部某一段序列發(fā)生重復(fù)基因重排:基因組中原來不在一起的基因由于某些原因組合排列在一起,動態(tài)性突變(dynamic mutation),以三核苷酸為單位的重復(fù)序列在傳遞

22、過程中 不穩(wěn)定,會發(fā)生擴(kuò)展,即子代的重復(fù)次數(shù)往 往較親代大為增加,因此又稱動態(tài)性突變。 脆性X綜合征:CGG重復(fù) 少年脊髓型共濟(jì)失調(diào):GAA重復(fù) 亨廷頓病:CAG重復(fù),X染色體(xq27.3)的脆性位點,脆性X綜合征是遺傳性智力缺陷最常見的一種。 致病基因FMR-1的5’端有CGG三核苷酸重復(fù)區(qū)。 普通男性群體中的患病率為1/4000。 普通女性群體中的患病率為1/6000。 患者智力低下、語

23、言障礙、行為異常、呈特殊 面容。,正常個體:CGG重復(fù)次數(shù)6~52次,中國人群以(CGG)28為多見。前突變(premutation): (CGG) 53~230為攜帶者,雖表型正常,但在傳 遞過程中易發(fā)生進(jìn)一步擴(kuò)展,使后代的CGG重復(fù)次數(shù)大大增加,并 有異常表型。全突變: (CGG) ≥230時,100%的男性表現(xiàn)為典型的脆性X綜合征, 53%的女性表現(xiàn)為程度不同的智力低下。,遺傳性疾病基因診斷的策略,(一)

24、直接診斷策略 基因診斷的直接策略是通過各種分子生物學(xué)技術(shù)檢測基因的遺傳缺陷,因此直接診斷的前提是被檢測基因的正常序列和結(jié)構(gòu)必須被闡明。 直接診斷由于是直接揭示遺傳缺陷,因而比較可靠。,,DMD的基因檢測,Duchenne muscular dystrophy (DMD) 是一種高發(fā)病率、高致殘、高致死的X連鎖的遺傳性疾病,在3500個活產(chǎn)男嬰中即有一個患者。 DMD基因的全長為250kb,有79個外顯子。 DMD 的

25、最主要遺傳缺陷是外顯子缺失,約占 60%~70%。,DMD基因外顯子的檢測,,(二)間接診斷策略,間接診斷的實質(zhì)是在家系中進(jìn)行連鎖分析,通過分析可確定個體來自雙親的同源染色體中的哪一條為致病染色體,從而判斷該個體是否帶有致病基因。 間接診斷不是尋找 DNA 的遺傳缺陷,而是通過分析DNA的遺傳標(biāo)記的多態(tài)性估計被檢者患病的可能性。,間接診斷:分析DNA的遺傳標(biāo)記的多態(tài)性,雙等位基因(bi-allele)多態(tài)性:限制性

26、片段長度多態(tài)性(RFLP) 第一代DNA遺傳標(biāo)記,所含信息量有限。 檢測技術(shù):Southern印跡技術(shù),多等位基因多態(tài)性(multi-allele),小衛(wèi)星序列又稱串聯(lián)重復(fù)可變數(shù)目(variable number tandem repeats,VNTR)第二代DNA遺傳標(biāo)記以 6~70bp 為單位,以串聯(lián)形式排列,構(gòu)成數(shù)量可變的串聯(lián)重復(fù)序列等位基因常常達(dá)10個以上,信息量比 RFLP大

27、 檢測技術(shù):PCR,,微衛(wèi)星序列 (microsatellite)以 2~6bp 為單位,重復(fù)次數(shù)可達(dá)幾十次,又稱短串聯(lián)重復(fù)序列(STR) 。在基因組中分布廣泛,出現(xiàn)的數(shù)目和頻率不同,具高度多態(tài)性。 檢測技術(shù):PCR,單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide poly- morphism,SNP),第三代DNA的遺傳標(biāo)記,其多態(tài)性僅表現(xiàn)為 單個核苷酸的變異。在人類基因組中的數(shù)目

28、可達(dá)300萬個,是一種信息量非常大的標(biāo)記系統(tǒng)。 檢測技術(shù):DNA芯片技術(shù),,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,C50: C49: C45: C44: Cjp:,11223,C50: C49: C45: C44: Cjp:,12212,21313,C50:

29、 C49: C45: C44: Cjp:,21121,21313,C50: C49: C45: C44: Cjp:,21121,21313,C50: C49: C45: C44: Cjp:,21121,12212,C50: C49: C45: C44: Cjp:,,12212,C50: C

30、49: C45: C44: Cjp:,21313,C50: C49: C45: C44: Cjp:,11223,12212,C50: C49: C45: C44: Cjp:,21313,C50: C49: C45: C44: Cjp:,21313,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,1

31、3,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,,,,,,,凝血因子Ⅷ(F8)基因的主要遺傳缺陷,點突變(point mutation) 缺失(deletion)倒位(invertion):發(fā)生于第22號內(nèi)含子,可在40%-50%重型HA中檢測到,間接診斷的不確定性,遺傳標(biāo)記所帶的信息性有限新突變基因重組家系成員不完整,三、基因檢測在多基因病中的應(yīng)用,,,多基因病具一定的遺傳因素,家庭發(fā)病率高于人群發(fā)病率,但是

32、疾病的產(chǎn)生都以一定的環(huán)境條件為誘因,遺傳因素在其中所起作用程度各異。,多基因病中的遺傳因素是若干個易感基因微小作用的累加,某一易感基因結(jié)構(gòu)的變化不足以導(dǎo)致疾病的產(chǎn)生。,人類基因組多態(tài)性是多基因病基因診斷的基礎(chǔ),易感基因多態(tài)性的檢測能幫助我們理解多基因病發(fā)生的機(jī)制,有助于對疾病的診斷和分類。,高血壓候選基因多態(tài)性分析在EH中的應(yīng)用前景,臨床分型 靶器官損傷研究 個體化治療,基因多態(tài)性與鹽敏感性高血壓,?-內(nèi)收素血管緊張素轉(zhuǎn)換酶

33、上皮鈉通道血管緊張素原心鈉素 ?2腎上腺素能受體 SA G蛋白亞單位3………,基因多態(tài)性與高血壓靶器官損傷,腦卒中 載脂蛋白E ?-纖維蛋白原 血管緊張素原 血管緊張素II的1型受體 內(nèi)皮型一氧化氮合酶 心鈉素,冠心病 副氧酶 凝血因子V 凝血因子VII 載脂蛋白B,ACE基因多態(tài)性與高血壓靶器官損傷,疾病

34、 研究報告數(shù) I D DD冠心病 30 + 11 % + 32 % 心肌梗死 15 + 12 % + 39 %腦卒中 5 + 22 % + 94 %高血壓腎病 19 + 10 % + 53 %糖尿病腎病 11 + 40 %

35、 + 56 % * 與II型相比,DD型和ID型發(fā)生上述疾病的危險性增高程度 (ACE基因I/D多態(tài)性研究49959例的薈萃分析),,ACE基因多態(tài)性:16號內(nèi)含子有一Alu重復(fù)序列,為插入/缺失多態(tài)性,構(gòu)成II、ID、DD三種基因型,基因多態(tài)性檢測與個體化治療,人類基因組計劃已經(jīng)完成,功能基因組研究正在實施。 有朝一日,臨床醫(yī)師能根據(jù)病人易感基因的多態(tài)性設(shè)計有效的、個

36、體化的治療方案,以達(dá)到最佳治療效果。,ATG基因多態(tài)性研究,目的:觀察ATG基因分型與限鈉鹽攝入及減輕體重后的 血壓變化和高血壓發(fā)病率間的關(guān)系對象:1509例基因分析:ATG基因G-A多態(tài)性結(jié)果:三年后高血壓發(fā)生率(%) 對照組 限鹽組 減輕體重組 AA型 45

37、 28 25 GG型 32 41 32 Hunt SC,et al: Hypertension, 1998;32:393-401,,,基因多態(tài)性分析指導(dǎo)抗高血壓藥物的選擇,藥物種類 基因

38、 利尿劑?-內(nèi)收素 ACE抑制劑ACE、AT1?-受體阻滯劑G蛋白(Gs?),四、腫瘤相關(guān)基因檢測在腫瘤病情監(jiān)測中的應(yīng)用,,,腫瘤是由于遺傳物質(zhì)(腫瘤相關(guān)基因)發(fā)生突變而導(dǎo)致的疾病。腫瘤相關(guān)基因的突變只是增加了個體對腫瘤的易感性而并不一定馬上產(chǎn)生腫瘤,腫瘤的發(fā)生是一個多因素、多步驟打擊的過程。,實時定量RT-PCR技術(shù)在急性早幼粒細(xì)胞白血病中的應(yīng)用,PML-RAR?融合基因是

39、 APL特異的分子標(biāo)志,,初發(fā)APL的PML-RAR?融合基因的拷貝數(shù)均大于1000。經(jīng)全反式維甲酸、ATRA +化療、三氧化二砷 治療獲得緩解后,其PML-RAR?融合基因的拷 貝數(shù)明顯降低,并隨著鞏固治療的進(jìn)行而進(jìn)一步降低。,,長期無病生存的患者的PML-RAR?融合基因的拷貝數(shù)均長期低于200一旦患者的檢測值高于該值,則強(qiáng)烈提示復(fù)發(fā)的可能,,APL完全緩解和復(fù)發(fā)時PML-RAR?融合基因的檢測,C

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