分子診斷學(xué)緒論感染性疾病的分子診斷教育

1、,,整體水平,細(xì)胞水平,分子水平,Chapter 6 核酸的分離與純化Chapter 7 重組DNA技術(shù)Chapter 8 臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)技術(shù)Chapter 9 核酸分子雜交技術(shù),Chapter 10 核酸測(cè)序技術(shù)Chapter 11 生物芯片技術(shù)Chapter 12 基因變異檢測(cè)技術(shù)、脈沖電場(chǎng)凝膠電泳、分子影像Chapter 13 生物信息學(xué)在分子診斷中的應(yīng)用,Section 1 分子診斷學(xué)的性質(zhì)、任務(wù)和特點(diǎn),分子診斷學(xué)

2、(molecular diagnostics)，利用分子生物學(xué)技術(shù)研究機(jī)體外源和內(nèi)源性生物大分子和大分子體系的存在、結(jié)構(gòu)或表達(dá)調(diào)控的改變，從而為疾病的防治提供分子水平信息。,分子診斷學(xué)的任務(wù),闡明疾病發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制；分子診斷指標(biāo)；建立檢測(cè)方法,分子診斷學(xué)的特點(diǎn),屬于病因?qū)W診斷，特異性高；對(duì)某些基因變異做出判斷；有更好的發(fā)展前景,Section 2 分子診斷學(xué)的歷史、現(xiàn)狀和未來(lái),疾病基因突變譜，尤其是單核苷酸多態(tài)性(sing

3、le nucleotide polymorphism, SNP)圖譜的建立，為分子診斷提供了強(qiáng)有力的工具。,基礎(chǔ)篇內(nèi)容,Chapter 1 基因組 GenomeChapter 2 原核生物基因組ProkaryoticChapter 3 真核生物基因組EukaryoticChapter 4 病毒基因組 VirusChapter 5 蛋白質(zhì)組學(xué) Proteomics,技術(shù)篇內(nèi)容,,Chapter 14 感染性疾病的分子診斷,Key

4、PointsMolecular diagnosis of infection disease means to estimate a disease through detecting the existence of gene of pathogenies directly, which is a relatively simple, rapid, specific and sensitive strategy of diagnos

5、is. pathogeny：病原，發(fā)病機(jī)理,There are two main kinds of molecular techniques which are used to molecular diagnosis of infection disease, amplifying DNA probe signals and amplifying target DNA fragment. amplify：放大；pro

6、be：探針,3. Associated with conventional diagnosis methods, molecular diagnosis can be used to diagnose infection disease induced by virus, bacteria, leptospira螺旋體, chlamydia衣原體, mycoplasma支原體 and rickettsia立克次體, etc.,4.

7、Compared with other conventional diagnosis methods, molecular diagnosis has many advantages in early diagnosing infection disease, identifying the genotype of pathogenies, detecting drug resistance gene, epidemiologic in

8、vestigating and supplying reliable evidence for clinical diagnosis and treatment.,感染性疾病的分子診斷主要是針對(duì)侵入人體內(nèi)的病原體基因進(jìn)行檢測(cè)。不同的病原體有各自的種屬特異的基因。前人鋪路，后人受益,Section 1 總論一、感染性疾病分子診斷的策略,一般性檢出策略：只需要提供是否有某種病原體的感染通過(guò)探針或擴(kuò)增技術(shù)直接檢出病原微生物的DNA/R

9、NA，判斷有無(wú)感染或何種感染,2. 完整檢出策略：不僅對(duì)病原體做出判斷，還要進(jìn)行分型（包括亞型）和耐藥性方面的檢測(cè)。 思路：診斷—分型—亞型—耐藥性檢測(cè),二、感染性疾病分子診斷的常用方法,信號(hào)放大檢測(cè)技術(shù)方法 不涉及靶分子擴(kuò)增，采用多酶、多探針或二者結(jié)合等方式增加探針標(biāo)記物的濃度從而使信號(hào)得到放大，提高檢測(cè)的靈敏度。如：液相雜交、雜交捕獲及支鏈DNA（bDNA）等特點(diǎn) 美國(guó)FDA批準(zhǔn)的商業(yè)試劑盒

10、 感染因素少，無(wú)擴(kuò)增所產(chǎn)生的污染 穩(wěn)定性、重復(fù)性和特異性都較高，結(jié)果準(zhǔn)確 放大倍數(shù)少，靈敏度較低,2. 靶分子擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)方法 即方法中包含靶分子（DNA、RNA或探針）的擴(kuò)增過(guò)程的技術(shù)。如PCR及衍生的擴(kuò)增技術(shù)、連接酶鏈反應(yīng)（LCR）、替代的擴(kuò)增方法（TAS/SDA/NASBA等）特點(diǎn) 我國(guó)所售的商業(yè)試劑盒 簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高 存在擴(kuò)增所帶來(lái)的

11、污染問(wèn)題,三、感染性疾病分子診斷的標(biāo)本處理,標(biāo)本的選擇標(biāo)本量及抗凝劑標(biāo)本的傳送、保存標(biāo)本的預(yù)處理,標(biāo)本的選擇與傳統(tǒng)一樣，標(biāo)本的選擇要符合疾病的發(fā)病機(jī)制，能反映病程的狀態(tài)。由于檢測(cè)方法的高靈敏性，可適當(dāng)考慮標(biāo)本采集的便利性和通用性。由于核酸樣本的穩(wěn)定性，可選用福爾馬林及石蠟包埋固定的組織標(biāo)本。核酸的選擇對(duì)疾病的判斷也很重要。什么時(shí)候用DNA？什么時(shí)候用mRNA?,標(biāo)本量及抗凝劑少量標(biāo)本：100ul-500ul不等

12、，至多1ml。不同的檢測(cè)方法，所需的標(biāo)本量不一樣?？鼓齽篍DTA、檸檬酸、草酸鹽、肝素。肝素對(duì)轉(zhuǎn)錄酶和聚合酶有抑制作用，因此，基于PCR的檢測(cè)方法一般不用肝素抗凝。,標(biāo)本的傳送、保存根據(jù)標(biāo)本的種類和檢測(cè)目的，建立合理的運(yùn)送體系。保證核酸完整性，防止標(biāo)本相互間的交叉污染。,標(biāo)本的預(yù)處理核酸的提取(DNA提取、 RNA提取)擴(kuò)增抑制物的去除危險(xiǎn)病原體的滅活,四、感染性疾病分子診斷的結(jié)果解釋,解釋?xiě)?yīng)包括病原體的生物學(xué)

13、、病理學(xué)特征、實(shí)驗(yàn)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)及局限性。陰性結(jié)果陽(yáng)性結(jié)果定性檢測(cè)結(jié)果疾病狀況的判斷,陰性結(jié)果解釋檢查質(zhì)控是否正常。檢查檢測(cè)靈敏度、核酸提取量及擴(kuò)增效率是否正常。引起假陰性的因素：樣品量不足、標(biāo)本類型不恰當(dāng)、收集時(shí)間不符合要求、運(yùn)輸過(guò)程中樣本降解。,陽(yáng)性結(jié)果解釋檢測(cè)質(zhì)控是否正常。注意檢測(cè)的特異性和可能受到的污染等情況。產(chǎn)生假陽(yáng)性的因素：引物探針的特異性、樣本在采集、運(yùn)送和處理等不同環(huán)節(jié)中的交叉污染問(wèn)題。,定性檢測(cè)結(jié)果

14、解釋考慮定性檢測(cè)的局限性考慮特定情況下，核酸樣本的穩(wěn)定性和不易降解性。,疾病狀況的判斷病原體存在與患病之間的相關(guān)關(guān)系為正確判斷疾病應(yīng)：選擇具有代表性的標(biāo)本，采用具有說(shuō)服力的檢測(cè)方法，建立適量的臨界值。,五、感染性疾病分子診斷的臨床應(yīng)用及評(píng)價(jià),彌補(bǔ)血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)的缺陷檢測(cè)不能培養(yǎng)或生長(zhǎng)緩慢的病原微生物通過(guò)病原體的定量檢測(cè)監(jiān)測(cè)疾病微生物耐藥性的檢測(cè)細(xì)菌分型及流行病學(xué)的調(diào)查,Section 2 病毒的基因檢測(cè),SARS相

15、關(guān)冠狀病毒的分子診斷,2003年4月，香港研究者Peiris等報(bào)告了50 例SARS病人的臨床表現(xiàn)和病毒學(xué)研究結(jié)果。一種新的冠狀病毒 (Coronavirus) 是SARS 的致病原因。 (Lancet, 2003, 361: 9365),2003年4月，德國(guó)漢堡Bernhard-Nocht熱帶醫(yī)學(xué)研究所學(xué)者Drosten等用隨機(jī)擴(kuò)增技術(shù)，獲得一段長(zhǎng)度為300bp的核苷酸序列。根據(jù)這段序列，建立了檢測(cè)新冠狀病毒的常規(guī)和實(shí)時(shí)定量P

16、CR技術(shù)。 (nejm.org on April 10, 2003）,檢測(cè)標(biāo)本 痰液、咽拭子、鼻拭子、支氣管肺泡灌洗液 、血漿、糞便。檢測(cè)方法 1. 逆轉(zhuǎn)錄-巢式PCR (Reverse-Nested PCR) 2. 逆轉(zhuǎn)錄-實(shí)時(shí)PCR (Reverse-Real time PCR),有報(bào)道顯示，在可能SARS病人中病毒的檢出率為100%。在疑似SARS病人中的檢出率為23%。所有健康接觸者中未檢

17、測(cè)到病毒。,另一項(xiàng)研究顯示 檢測(cè)病毒的3種方法（血清學(xué)檢測(cè)、病毒分離、PCR技術(shù)）中，PCR技術(shù)的檢出率最高。,討論,疾病的早期即可獲得陽(yáng)性結(jié)果(早于血清轉(zhuǎn)換期）。SARS患者中的陽(yáng)性率約為80%，對(duì)照中的陰性率約為98%～100%?，F(xiàn)有的PCR方法有較高的特異性但靈敏度較差，陰性結(jié)果不能排除病毒感染。,痰液中病毒RNA濃度極高，說(shuō)明病毒從呼吸道排放是主要傳播途徑。血清中檢測(cè)到極低濃度的病毒RNA，提示病毒復(fù)制不僅發(fā)生于

18、呼吸道。病人恢復(fù)晚期的糞便中存在病毒RNA，說(shuō)明糞便可能也是一種傳播途徑。鼻、咽子中含有的病毒RNA顯著少于痰液，提示不適合作為標(biāo)本（有可能漏檢）。,SARS相關(guān)冠狀病毒基因檢測(cè)必須注意的問(wèn)題,必須在規(guī)范的基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。應(yīng)采取必要的質(zhì)控規(guī)程，包括陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。陽(yáng)性結(jié)果時(shí)必須對(duì)原始樣本重復(fù)檢驗(yàn)： 或者擴(kuò)增另一個(gè)基因片段 或在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)室對(duì)同一樣本進(jìn)行檢測(cè)。,肝炎病毒基因的檢測(cè)(hepatit

19、is B virus, HBV),乙肝病毒基因組中有4個(gè)ORF，分別稱為S、C、P和X。S區(qū)編碼HBV的包膜蛋白，C區(qū)編碼含HBeAg和HBcAg的多肽，P區(qū)編碼依賴RNA的DNA聚合酶。必須經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制過(guò)程，該病毒編碼的RNA-DNA polymerase缺乏校正功能導(dǎo)致變異率較高,臨床價(jià)值主要體現(xiàn)在：病情評(píng)估 血清中病毒含量的多少與肝臟病理?yè)p害程度相關(guān)，病毒載量越高，肝組織炎癥反應(yīng)程度越重。療效預(yù)測(cè) 治療前病毒核酸載

20、量越高，療效越差；載量越低，機(jī)體清除病毒的可能性越大。,預(yù)后判斷病毒核酸載量持續(xù)處于高濃度者預(yù)后不良。垂直傳播途徑感染者，預(yù)后較差。反映肝細(xì)胞損害的其它指標(biāo)正常，但病毒核酸水平經(jīng)常波動(dòng)者更易發(fā)展為肝硬化。,病毒分型和耐藥檢測(cè)各個(gè)編碼區(qū)段存在著大量有意義的自然變異或藥物誘導(dǎo)的變異，并由此產(chǎn)生不同的變異株，從而導(dǎo)致HBV感染的不同血清學(xué)和臨床表現(xiàn)。檢測(cè)HBV的變異株對(duì)了解疾病機(jī)制、藥物耐受和指導(dǎo)用藥有一定的價(jià)值。參考ATCC

21、HepG2 Cell Culture,HPV基因的檢測(cè)在預(yù)防宮頸癌中的作用人乳頭瘤病毒(human papillomavirus, HPV),宮頸癌是常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤之一，發(fā)病率在女性惡性腫瘤中居第二位，每年約有50萬(wàn)左右新發(fā)病例。我國(guó)每年有新發(fā)病例約13.15萬(wàn)，占世界宮頸癌新發(fā)病例總數(shù)的26%。,持續(xù)的人乳頭瘤病毒(human papillomavirus, HPV) 感染是引起宮頸癌和癌前病變的必要因素，93.0%-99.7

22、%的宮頸癌組織中均可檢測(cè)到HPV DNA。高危型HPV-16和HPV-18分別占宮頸癌的50%和14%。高危型HPV的持續(xù)感染可使患宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)增加250倍。,HPV DNA的檢測(cè)方法實(shí)時(shí)定量PCR (Real time PCR)核酸雜交捕獲（Hybrid CaptureII，HCII）,細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果為意義不明確的非典型細(xì)胞時(shí)，HPV基因的檢測(cè)能預(yù)測(cè)受檢者患宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)。細(xì)胞學(xué)檢查+HPV基因的檢測(cè)是宮頸癌前病變和宮頸癌篩查的

23、最佳方法，成為預(yù)防宮頸癌的關(guān)鍵,HIV基因的檢測(cè)人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV),參考NSFC申請(qǐng)材料,單純皰疹病毒(herpes simplex virus,HSV),巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus virus, CMV),Section 3 病原菌的基因檢測(cè),結(jié)合分歧桿菌的基因檢測(cè),結(jié)核分歧桿菌MTb，俗稱結(jié)核桿菌TB，是結(jié)核病的致病菌。帶病菌的痰液是TB主要的傳染

24、源。MTbH37Rv基因組結(jié)構(gòu)：環(huán)狀雙鏈DNA，共4 411 529kb，富含重復(fù)序列尤其是插入序列、多基因的家族序列及重復(fù)的管家基因序列。,TB分子診斷方法1,臨床標(biāo)本處理：標(biāo)本：痰、胸腹腔積液、血清、尿液、腦脊液處理：液化劑去除粘蛋白，若帶血?jiǎng)t用紅細(xì)胞裂解液去除血紅蛋白，提取DNA,TB分子診斷方法2,常用的是靶分子擴(kuò)增方法：直接PCR法、SDA法、LCR法擴(kuò)增片段：抗原蛋白編碼基因-165bp、MBP64-240bp、