線粒體疾病的分子診斷

1、線粒體疾病的分子診斷Molecular diagnosis for mitochondrial related disorders,,2,線粒體（Mitochondrion）,2,1. 動(dòng)物細(xì)胞中的細(xì)胞器，二分裂方式進(jìn)行新陳代謝，平均壽命10天2. 每個(gè)細(xì)胞含幾百到幾千個(gè)線粒體3. 每個(gè)線粒體含2-10 線粒體DNA（mtDNA）,3,,線粒體功能,,Mitochondrial Disease.Chest 2001; 120:6

2、34–648,,,,ATP,,,,脂肪酸代謝,三羧酸循環(huán),氧化磷酸化,其他功能,,儲(chǔ)存鈣離子 調(diào)節(jié)膜電位并控制細(xì)胞程序性死亡 細(xì)胞增殖與細(xì)胞代謝的調(diào)控 合成膽固醇及某些血紅素,——Wikipedia,,線粒體病 Mitochondrial disorders,發(fā)現(xiàn)- 1962 年， Lufe 等發(fā)現(xiàn)一位年輕的瑞典婦女伴有異常增高的基礎(chǔ)代謝率，同時(shí)伴有線粒體結(jié)構(gòu)的異常和氧化磷酸化功能的異常。直到1988年， Wallace

3、等報(bào)道了首例由線粒體 DNA突變引起的人類疾病，明確了mtDNA 突變可引起人類疾病。 定義- 是遺傳缺損引起線粒體代謝酶缺陷，致使ATP合成障礙、能量來源不足導(dǎo)致的一組異質(zhì)性病變，又稱為線粒體細(xì)胞病。發(fā)病率- 約為1:5000（約每5000人中1人發(fā)?。?Smeitink 2006,,,線粒體病 mitochondrial disorders,—— 是一組高度臨床變異性和遺傳異質(zhì)性的疾病,線粒體蛋白,,16,569 bp

4、circular double stranded (mtDNA)20%,1,500 nuclear genes 80%,,,（結(jié)構(gòu)和功能）,,structural protein of the OXPHOS complexes protein required for assembly of OXPHOS complexes proteins involved in mtDNA translation proteins in

5、volved in mtDNA maintenance proteins involved in mitochondrial fusion and fission,Douglas C. Wallace, 1817–1819,——Shoubridge, 2001; Schapira，2000,,進(jìn)一步導(dǎo)致線粒體功能異常：,①底物的運(yùn)輸缺陷；②底物的利用缺陷；③檸檬酸循環(huán)異常；④氧化磷酸化脫偶聯(lián)；⑤呼吸鏈異常。,,,發(fā)病特點(diǎn),

6、,核基因突變——常染色體隱性、顯性遺傳或X-連鎖遺傳 （目前已鑒定的核基因突變約40種）,線粒體基因突變——母系遺傳 （突變的mtDNA在母血增加，受累及的后代發(fā)病頻率增加）,mtDNA突變與臨床表型之間關(guān)系復(fù)雜，主要表現(xiàn)為同一種mtDNA突變可以引發(fā)多種不同的疾病表型，而同一種疾病表型又可以由多種不同的mtDNA突變

7、誘導(dǎo)。,遺傳異質(zhì)性,,嬰幼兒起病較常見,編碼線粒體結(jié)構(gòu)蛋白的核基因突變進(jìn)行性外眼肌麻痹（PEO）、線粒體神經(jīng)腸胃腦肌病、Leigh氏綜合征 線粒體蛋白質(zhì)翻譯相關(guān)的核基因突變2004年Miller等首次報(bào)道核基因編碼的線粒體核糖體蛋白亞單位16(MRPS16)純合突變，導(dǎo)致先天畸形伴張力衰竭、四肢水腫、肝轉(zhuǎn)氨酶活性升高并乳酸亞基中毒癥， 該女嬰在出生后3天死亡。,核基因突變,,線粒體基因突變,突變的影響： 引起呼吸鏈功能缺陷

8、 氧化磷酸化酶異常 閾值效應(yīng)：組織特異性 復(fù)制分離 母系遺傳：不同突變后代發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)不同。 相比A8344G突變，攜帶 A3243G突變的母系后代更容易發(fā)病。 突變分布：同質(zhì)性——各器官組織分布相同 異質(zhì)性——不同組織、細(xì)胞分布不同,,一般特點(diǎn),同質(zhì)

9、性突變與異質(zhì)性突變,11,線粒體基因同質(zhì)性（Homoplasmy）0 或 100%異質(zhì)性（Heteroplasmy） 0-100%,核基因純合子（Homozygous） 0 或 100%雜合子（Heterozygous）50%,線粒體基因突變,點(diǎn)突變 目前已報(bào)道的mtDNA 點(diǎn)突變將近330種，涉及mtDNA編碼的各個(gè)基因，其中結(jié)構(gòu)基因突變177種、tRNA基因突變137種、rRNA基因突變12種、D-Loop區(qū)突變

10、2種 LHON、線粒體腦肌病合并乳酸血征及卒中發(fā)作綜合征、肌陣攣癲癇、破碎紅纖維病、母系遺傳糖尿病伴耳聾綜合征等重排 重排突變逾數(shù)百 遺傳性痙攣性截癱等 (http：//www.mitomap.org),,線粒體疾病是復(fù)雜性疾病,遺傳方式復(fù)雜常染色體隱性遺傳（

11、Autosomal Recessive）常染色體顯性遺傳（Autosomal Dominant）性連鎖遺傳（Sex linked）母系遺傳（Maternally inherited）臨床表型復(fù)雜累及多系統(tǒng)（Multisystemic involvement）影響幾乎所有組織器官（Any organ or tissue can be affected）,13,線粒體病的共同臨床特點(diǎn),嬰兒期發(fā)?。?常見于嬰兒伴隨COX陰

12、性肌纖維、腦病和Leigh綜合征。 兒童發(fā)?。?見于MELAS、MERRF、Leigh病、線粒體肌病、線粒體心肌病和KSS。 中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害： 共濟(jì)失調(diào)、癲癇、肌張力下降、脊髓病等 周圍神經(jīng)損害： 交感神經(jīng)病出現(xiàn)在MNGIE和Wolfram綜合征 視聽神經(jīng)損害： 視神經(jīng)病出現(xiàn)在Leber病和顯性遺傳視神經(jīng)萎縮1型 聽力喪失出現(xiàn)在KSS 肌肉病 見于線粒

13、體肌病、MELAS和KSS。眼外肌麻痹見于KSS和PEO,,（高度臨床變異性）,Chinnery et al. Lancet 2000,線粒體疾病的生化診斷,當(dāng)一個(gè)患者的基因變異不能被確定時(shí)，完整的生化檢查可以輔助診斷。,代謝產(chǎn)物分析（血液、尿液、腦脊液等）血液可以正常，但腦脊液多異常，（動(dòng)脈比靜脈好）；乳酸/丙酮酸比高(>50:1)提示呼吸鏈?zhǔn)艿阶钄唷Ｕ２怀饩€粒體疾病,酶測定 氧化磷酸化（OXPHOS）系統(tǒng)的酶活性測定

14、。（western、比色法等）方法不穩(wěn)定 一般情況下，血清CK正?；蜉p度升高；升高占30%見于慢性進(jìn)行性眼外肌麻痹；mtDNA丟失時(shí)非常高。,肌肉活檢線粒體病的肌肉病理改變特點(diǎn)：（1）出現(xiàn)線粒體結(jié)構(gòu)異常、細(xì)胞色素陰性肌纖維或RRF為主要病理改變。（2）上述病理改變出現(xiàn)的頻率高。（3）缺乏其他的肌肉病理改變。,,J inherit Metab Dis.2011 April;34(2):283-292,兒童及成人線粒體疾病的診斷

15、標(biāo)準(zhǔn),A 符合線粒體腦肌病各綜合征的臨床表現(xiàn) 如KSS、CPEO、MELAS、MERRF 等； 多系統(tǒng)不明原因發(fā)病 必須至少三個(gè)系統(tǒng)出現(xiàn)臨床癥狀 除先證者外，至少有一個(gè)母系家族成員有發(fā)病可能 排除其它代謝和非代謝疾病B 肌活檢在骨骼肌中存在>2%破碎樣紅肌纖維C 有以下一種或多種呼吸鏈酶活性受抑制的表現(xiàn)： 50歲以下肌活檢COX陰性肌纖維>2%； 50歲以上肌活檢COX陰性肌纖維5%； 任一組織種呼吸鏈

16、酶活性<20%； 任一細(xì)胞系中呼吸鏈酶活性<30%； 多于兩組織內(nèi)相同呼吸鏈酶活性<30%；,主要診斷標(biāo)準(zhǔn),,(Bernier et al, 2002)(3, 5),,次要診斷標(biāo)準(zhǔn)：,A 癥狀符合線粒體腦肌病的臨床表現(xiàn)；至少以下一種提示肌肉中線粒體異常的表現(xiàn)：①30~50歲肌活檢RRF在1%~2%；②30 歲以下肌活檢出現(xiàn)RRF；③電鏡下見廣泛線粒體異常；B 至少一種呼吸鏈功能受抑制的表現(xiàn)：①生化或極譜

17、描記的呼吸鏈復(fù)合物活性在20%~30%；②用免疫方法證實(shí)呼吸鏈復(fù)合物表達(dá)減少；C 發(fā)現(xiàn)可能相關(guān)的mtDNA 異常；D 一種或多種氧化磷酸化受損的表現(xiàn)：①腦脊液或血中乳酸、丙酮酸和(或)丙氨酸增高；②若疑為KSS，腦脊液蛋白質(zhì)增高；③PET或31P-MRS證實(shí)肌肉或腦代謝降低；④最大氧分壓、平均氧分壓或乳酸閾值降低。,,(Bernier et al, 2002)(3, 5),符合以上2個(gè)主要診斷指標(biāo)或1個(gè)主要診斷指標(biāo)及2個(gè)次

18、要診斷指標(biāo)的即為確診線粒體病； 符合1個(gè)主要診斷指標(biāo)及1個(gè)次要診斷指標(biāo)或至少3個(gè)次要診斷指標(biāo)的為擬診線粒體?。?符合1個(gè)主要診斷指標(biāo)或在符合臨床表現(xiàn)的基礎(chǔ)上還具備1個(gè)次要診斷指標(biāo)的為疑診線粒體病。,J inherit Metab Dis.2011 April;34(2):283-292,,線粒體病診斷時(shí)應(yīng)注意,基因診斷與生化檢查如能量代謝情況、呼吸鏈和酶復(fù)合體活性等相結(jié)合 要區(qū)分病理性突變和正常衰老所致的線粒體基因突變 線粒體基

19、因異常與臨床表現(xiàn)的嚴(yán)重程度之間存在量效關(guān)系 散發(fā)與遺傳的相關(guān)性 ，診斷是否遺傳需排除環(huán)境、藥物和衰老等因素,第一節(jié) 線粒體基因組與疾病,線粒體基因組及其表達(dá)系統(tǒng)http://www.mitomap.org線粒體基因組與細(xì)胞核基因組的相互關(guān)系線粒體基因組變異與疾病,20,21,,,人類線粒體基因組,,Light strand: 8 tRNA and 1 mRNA (ND6)Heavy strand: 14 tRNA, 2 r

20、RNA, and 12 mRNAPolycistronic with posttranscriptional processing,,基因組小, 僅16569 bp 雙鏈環(huán)狀DNA 13 結(jié)構(gòu)基因 / mRNA 22 tRNA 基因 2 rRNA 基因 12S rRNA 基因 16S rRNA 基因 非編碼區(qū) D-loop（約1120bp） L鏈復(fù)制起始區(qū)（約30～50bp，tRNAAsn-tRNACys

21、） 高突變率,,線粒體基因組及其表達(dá)系統(tǒng),The two strands of mtDNA are differentiated by their nucleotide content with the guanine rich strand referred to as the heavy strand, and the cytosine rich strand referred to as the light strand.

22、 The heavy strand encodes 28 genes, and the light strand encodes 9 genes for a total of 37 genes. Of the 37 genes, 13 are for proteins (polypeptides), 22 are for transfer RNA (tRNA) and two are for the small and large

23、 subunits of ribosomal RNA (rRNA).,2 rRNAsMitochondrial rRNA is encoded by MT-RNR1 (12S rRNA) MT-RNR2 (16S rRNA).,Human mitochondrial DNA (mtDNA) has three promoters, H1, H2, and L (heavy strand 1, heavy strand 2, and

24、 light strand promoters). The H1 promoter transcribes the entire heavy strand and The L promoter transcribes the entire light strand. The H2 promoter causes the transcription of the two mitochondrial rRNA molecules.,T

25、he process of transcription initiation in mitochondria involves three types of proteins: the mitochondrial RNA polymerase (POLRMT), 2. mitochondrial transcription factor A (TFAM), 3. mitochondrial transcription factor

26、s B1 and B2 (TFB1M, TFB2M).,第一節(jié) 線粒體基因組與疾病,線粒體基因組及其表達(dá)系統(tǒng)線粒體基因組與細(xì)胞核基因組的相互關(guān)系線粒體基因組變異與疾病,26,核基因組與線粒體基因組的相互作用,27,核基因組編碼了1500多個(gè)線粒體蛋白,線粒體基因組只編碼了13條多肽鏈,“交叉對話（cross-talk）”機(jī)制,第一節(jié) 線粒體基因組與疾病,線粒體基因組及其表達(dá)系統(tǒng)線粒體基因組與細(xì)胞核基因組的相互關(guān)系線粒體基因組

27、變異與疾病線粒體基因組變異堿基突變：點(diǎn)突變。其中結(jié)構(gòu)基因的點(diǎn)突變，與核基因組一樣，包括同義突變和錯(cuò)義突變?nèi)笔c插入：mtDNA拷貝數(shù)目突變：線粒體基因組變異與疾病耳聾，Leber遺傳性視神經(jīng)病變，糖尿病，高血壓，腫瘤,28,29,在線粒體相關(guān)疾病中常見的DNA點(diǎn)突變,MELAS綜合征（線粒體腦肌病乳酸酸中毒及卒中樣發(fā)作）：A3243G (80%), T3271C（在tRNA Leu(UUR)基因）MERRF（肌陣攣性癲癇

28、伴破碎紅纖維）： A8344G (80%), T8356C（在tRNALys基因）Leber視神經(jīng)?。↙HON）： G11778A（在ND4基因），G3460A（在ND1基因）耳聾（Deafness）: A1555G, T1494C（在12S rRNA基因）A3243G（在tRNALeu(UUR)基因）2型糖尿病（Type 2 Diabetes）: A3243G（在tRNALeu(UUR)基因） NARP（共濟(jì)失調(diào)伴色

29、素性視網(wǎng)膜炎神經(jīng)病）：T8993G, T8993C（在ATPase 6 基因）,,線粒體病的分子診斷,標(biāo)本選擇： 外周血白細(xì)胞——最常用 毛發(fā) 唾液 尿液 骨骼肌——檢測 mtDNA分子診斷的最好標(biāo)本,,,,檢測已知DNA突變的方法： 等位基因特異性寡核苷酸雜交（ASO） 等位基因特異性擴(kuò)增（ASA） 限制性片段長度多態(tài)性分析（PCR-RLFP） 連接酶鏈反應(yīng)（LCR） 基因芯片技術(shù),檢測未知D

30、NA突變的方法： 單鏈構(gòu)象多態(tài)性（PCR-SSCP） 變性梯度凝膠電泳（DEEG） 異源雙鏈分析（HA） DNA序列測序 變性高效液相色譜（DHPLC）,分子診斷方法,線粒體疾病中常見的突變,核基因突變（nuclear gene mutations）氧化磷酸化系統(tǒng)由核基因編碼的蛋白質(zhì), 例如: Surf1, SCO2, NDUFV1, NDUFS1,etc.呼吸鏈缺陷: 重復(fù)、缺失線粒體DNA點(diǎn)突變（mtDNA

31、 point mutations）LHON, MELAS, MERRF, NARP, etc.mtDNA缺失/重復(fù)（mtDNA Deletions/duplications） eg. KSS, Pearson synd, diabetes & deafness未知遺傳（unknown inheritance）,32,第二節(jié) 線粒體基因組與耳聾,與耳聾相關(guān)的mtDNA突變耳聾相關(guān)的mtDNA突變的檢測,33,第二節(jié)

32、線粒體基因組與耳聾,與耳聾相關(guān)的mtDNA突變耳聾相關(guān)的mtDNA突變的檢測PCR-RFLP技術(shù)DHPLC技術(shù)DNA測序技術(shù)基因芯片技術(shù),34,第三節(jié) 線粒體與Leber遺傳性視神經(jīng)病變,與Leber遺傳性視神經(jīng)病變相關(guān)的mtDNA突變Leber遺傳性視神經(jīng)病變相關(guān)的mtDNA突變常用檢測技術(shù),35,Degeneration of retinal ganglion cells and their axons

33、Inherited from maternal mitochondrial DNAOccurs during young adulthood,Acute Phase:Painless, acute onset of central vision lossLoss of visual acuity/colouronce symptoms appear in one eye, other eye affected weeks la

34、ter,Sub acute Phase atrophy of optic disc legally blind,Asymptomatic until visual blurring develops,Signs and Symptoms,Maternal inheritanceMutation occurs in mitochondrial DNA (mtDNA)Only the egg contributes mtDNA

35、to the embryo,,,,Genetics of LHON,(1) G11778A: 50-60% LHON population(2) G3460A: 8-25% LHON population(3) T14484C: 10% LHON population,Single Point Mutations3 major pathogenic mutations:,,G14459A T1448

36、4C,,,,,presence of mixture of more than one type of organellar genome ie mtDNANumerous cell divisions and thus lots of time is required for mutant alleles to be expressed in mitochondriaSymptoms don’t appear until ad

37、ulthoodAlso implicated as the reason for variability in severity of vision loss,Heteroplasmy,Vision damage from degeneration of optic nerveMaternally inherited through mtDNA3 point mutationsComplex I ? ROS (reacti

38、ve oxygen species)TreatmentAntioxidantsInhibit mitochondrial-dependent apoptosis,第三節(jié) 線粒體與Leber遺傳性視神經(jīng)病變,與Leber遺傳性視神經(jīng)病變相關(guān)的mtDNA突變Leber病變相關(guān)的mtDNA突變常用檢測技術(shù)PCR-RFLP技術(shù)PCR-SSCP技術(shù)DHPLC技術(shù)DNA測序技術(shù),43,G3460A， G11778A，T11484

39、C原發(fā)性突變測序圖,,,,第四節(jié) 線粒體與糖尿病,線粒體糖尿病美國糖尿病協(xié)會(huì)(1997)/世界衛(wèi)生組織(1999)制定了新的糖尿病分型標(biāo)準(zhǔn)，將線粒體基因缺陷型糖尿病列為特殊類型糖尿病，屬于β細(xì)胞功能遺傳缺陷型糖尿病，約占糖尿病總數(shù)的1～3％據(jù)浙江省糖尿病防治中心提供的數(shù)據(jù)，浙江省糖尿病患病率為2.96%線粒體DNA突變與糖尿病線粒體糖尿病的檢驗(yàn)診斷,44,第四節(jié) 線粒體與糖尿病,線粒體糖尿病線粒體DNA突變與糖尿病線粒體

40、糖尿病的檢驗(yàn)診斷,45,第四節(jié) 線粒體與糖尿病,線粒體糖尿病線粒體DNA突變與糖尿病線粒體糖尿病的檢驗(yàn)診斷PCR技術(shù)正向引物（F）：5′-TTCACAAAGCGCCTTCCCCC-3′反向引物（R）：5′-GCGATGGTGAGAGCTAAGGTC-3′ 擴(kuò)增片段398 bp（3153～3551bp）DHPLC技術(shù)PCR-RFLP技術(shù)DNA測序技術(shù),46,,,,,,,,,分子診斷研究 （A3243G異質(zhì)性分析）,,

41、收集病人外周血,抽提DNA,PCR擴(kuò)增目的片段,PCR-RLFP,測序驗(yàn)證,RT-ARMs-qPCR,Pyrosequencing,Targeted Next-Generation Sequencing,,,,,,,High-throughput sequencing,實(shí)例,母系遺傳糖尿病家系,注：母系成員共24人，其中糖尿病患者為10人。,相應(yīng)PCR產(chǎn)物經(jīng)普通測序驗(yàn)證：,MIDD:,,PCR-RFLP,圖 含mtDNA 3243

42、PCR產(chǎn)物的限制性內(nèi)切酶（ApaI）酶切結(jié)果圖,mtDNA 3243 異質(zhì)性突變檢測結(jié)果,M：DNA marker；Lane 1、2、3、6、7、8、9、10、11、12、13、16、17：mtDNA 3243 異質(zhì)性突變；Lane 4、5、14、15：mtDNA 3243 未突變；,,限制酶ApaⅠ的酶切位點(diǎn)(GGGCC↓C),由于該突變?yōu)楫愘|(zhì)性突變, 故應(yīng)該會(huì)出現(xiàn)553、423、130 bp 共3 條條帶; 而野生型沒有A

43、paⅠ的酶切位點(diǎn), 故電泳只能看到長度為553 bp的1 條片段,應(yīng)用技術(shù)平臺(tái) Illumina GAllX,作為新一代分子生物學(xué)綜合技術(shù)平臺(tái)，Genome Analyzer測序技術(shù)避免了像傳統(tǒng)測序技術(shù)那樣耗費(fèi)大量人力、物力進(jìn)行片段克隆、轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒抽提等工作，具有高準(zhǔn)確性，高通量，高靈敏度，低運(yùn)行成本等突出優(yōu)勢，是目前市場占有率最高的第二代高通量基因測序儀。,Next Generation Sequencing (NGS),測序深度

44、（deep）： 是指測序得到的總堿基數(shù)與待測基因組大小的比值。假設(shè)一個(gè)基因大小為2M，測序深度為10X，那么獲得的總數(shù)據(jù)量為20M。覆蓋度（coverage）： 指測序獲得的序列占整個(gè)基因組的比例。由于基因組中的高GC、重復(fù)序列等復(fù)雜結(jié)構(gòu)的存在，測序最終拼接組裝獲得的序列往往無法覆蓋有所的區(qū)域，這部分沒有獲得的區(qū)域就稱為Gap。例如一個(gè)細(xì)菌基因組測序，覆蓋度是98%，那么還有2%的序列區(qū)域是沒有通過測序獲得的。Read ：高通

45、量測序平臺(tái)產(chǎn)生的序列標(biāo)簽,,線粒體DNA序列：16.6kb,,,3243位點(diǎn)捕獲到兩種堿基A/G,,support=6758（A）/903（G）,結(jié)果分析,,,heteroplasmy mutant=11%,,,Step1 and Step2:,Step3 and Step4；,Step5：,Pyrosequencing,DNA聚合酶,,,熒光素酶,,雙磷酸酶,,硫酸化酶,PyrosequencingTM焦磷酸測序技術(shù)是一種基于四種酶

46、（DNA聚合酶、硫酸化酶、熒光素酶和雙磷酸酶）的級(jí)聯(lián)反應(yīng)來進(jìn)行定量序列分析的技術(shù)。在整個(gè)反應(yīng)體系中，以PCR產(chǎn)物的一條單鏈為模板，與測序引物退火結(jié)合后，按照事先計(jì)算好的順序?qū)⑺姆NdNTP依次加到樣品中。,,雙峰,,,,焦磷酸測序Qiagen PyroMark Q24,QIAGEN公司最新的PyroMark Q24焦磷酸測序儀，采用成熟的焦磷酸測序技術(shù)，是集測序、樣品制備、試劑和對照以及完整和靈活的軟件于一體的系統(tǒng)。,不需要制膠