線粒體功能損傷與疾病的關(guān)聯(lián)研究.pdf

1、目的：
　　1.建立快速篩查快速、準(zhǔn)確、無創(chuàng)、低成本的線粒體糖尿病MT3243A＞G位點突變的篩查方法;
　　2.分析線粒體糖尿病患者外周血中MT3243A＞G突變對線粒體基因及線粒體功能的影響;
　　3.分析唐氏綜合征(DS)患者外周血單個核細(xì)胞中線粒體基因及核編碼的線粒體基因的表達(dá)變化。
　　方法：
　　1.1以采集自上海市兒童醫(yī)院和上海市第六人民醫(yī)院已確診的6例線粒體糖尿病患者及50例正常對照為研究對

2、象，采用焦磷酸測序方法檢測并比較不同來源樣本（血液、唾液及尿沉渣）中MT3243A＞G突變位點的雜合度水平。
　　1.2建立兩步法MT3243A＞G突變位點快速篩查體系:應(yīng)用高分辨率熔解曲線（high resolution melting curve analysis，HRM）技術(shù)對來自上海市4個社區(qū)的1070例糖尿病患者尿沉渣樣本中的MT3243A＞G突變位點進(jìn)行快速篩查，陽性樣本進(jìn)一步采用焦磷酸測序技術(shù)進(jìn)行驗證，并定量檢測突變

3、位點的雜合度水平。
　　2.研究線粒體糖尿病患兒線粒體功能的改變:采用qRT-PCR檢測來自于上海市第六人民醫(yī)院的4例線粒體糖尿病患者以及7例年齡配對的正常對照樣本中線粒體基因表達(dá);同時檢測這些樣本外周血單個核細(xì)胞中線粒體功能的改變情況（ATP含量、ROS含量及膜電位變化）。
　　3.研究唐氏綜合征患兒線粒體功能的改變:采用qRT-PCR檢測8例唐氏綜合征患兒及6例正常對照外周血樣本中線粒體DNA拷貝數(shù)及線粒體基因的表達(dá);采

4、用基因芯片技術(shù)檢測2例DS雙胞胎患者及2例正常對照外周血線粒體基因及能量代謝通路和氧化磷酸化通路中線粒體相關(guān)基因的表達(dá);采用PCR-Array技術(shù)檢測3例DS患者及3例正常對照外周血單個核細(xì)胞中的線粒體相關(guān)基因的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.建立了基于HRM和焦磷酸測序技術(shù)的線粒體糖尿病MT3243A＞G位點突變兩步法快速篩查方法。
　　1.1對比實驗發(fā)現(xiàn)，6例線粒體糖尿病患者尿沉渣中MT3243A＞G突變位點的雜合度均

5、高于唾液和血液2-7倍，唾液中突變雜合度略高于血液;50例正常對照的血液、唾液及尿沉渣樣本中均未檢出MT3243A＞G位點突變。
　　1.2在1070例糖尿病尿沉渣樣本的篩查實驗中，應(yīng)用HRM篩查出2例疑似MT3243A＞G位點突變的樣本，經(jīng)焦磷酸測序驗證后確認(rèn)為MT3243A＞G位點突變，兩個患者尿沉渣樣本中MT3243A＞G位點雜合度分別為33.32％和14.67％。
　　2.經(jīng)qRT-PCR檢測4例線粒體糖尿病患者以及

6、7例正常對照樣本外周血單個核細(xì)胞中13個線粒體基因的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，患者組的13個線粒體基因中ND3、ATP6、ATP8、COⅪ、COⅫ、COⅩⅢ基因的表達(dá)水平略高于正常對照組，其他基因表達(dá)略低于正常對照組，但均無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05);線粒體糖尿病患者外周血單個核細(xì)胞中空腹和餐后120min時平均ATP含量低于正常對照組(1.83E+04vs2.67E+04;1.32E+04 vs2.09E+04)，且差異顯著(P＜0.05);線粒體

7、糖尿病患者外周血單個核細(xì)胞中空腹和餐后120min時平均ROS含量高于正常對照組(0.114vs0.077，0.113 vs0.075)，且差異極顯著(P＜0.01);與正常對照組相比，線粒體糖尿病患者外周血單個核細(xì)胞中膜電位受到一定的損傷。
　　3.采用RT-PCR檢測8例DS及6例正常對照的外周血樣本發(fā)現(xiàn)DS患者中mtDNA拷貝數(shù)明顯高于正常對照組，且差異顯著(P＜0.05);在兩組13個線粒體基因表達(dá)的比較中，DS患者中CO

8、Ⅺ、COⅩⅢ、ATPase6的表達(dá)略低于正常對照組，其他基因表達(dá)略高于對照組，但均無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05);基因芯片檢測分析，DS中13個線粒體基因的表達(dá)無顯著變化，能量代謝通路中涉及的84個線粒體相關(guān)基因中只有TOMM40基因表達(dá)下調(diào)。氧化磷酸化復(fù)合物中的84個線粒體相關(guān)基因中ATP5J和ATP50表達(dá)上調(diào);經(jīng)PCR-Array技術(shù)檢測的3例DS患者與3例正常對照相比，外周血單個核細(xì)胞中84個線粒體相關(guān)基因中共有49個基因表達(dá)下調(diào)

9、。
　　結(jié)論：
　　1.尿沉渣樣本取材方便、無創(chuàng)、突變雜合度高，可以作為人群中MT3243A＞G位點突變篩查的首選樣本;HRM技術(shù)使用成本低，可以實現(xiàn)點突變的快速篩查，焦磷酸測序技術(shù)檢測靈敏度高、定量精確。我們將兩者的優(yōu)勢相結(jié)合，建立了兩步法快速篩查檢測線粒體糖尿病MT3243A＞G位點突變的新方法。
　　2.線粒體糖尿病MT3243A＞G突變對患者體內(nèi)ATP水平、ROS及線粒體膜電位有一定的影響。
　　3.唐氏