機械通氣相關(guān)性肺損傷中NLRP3蛋白與線粒體功能的變化.pdf

1、研究目的:
　　機械相關(guān)性肺損傷（ventilator-induced lung injury，VILI）是一種在應(yīng)用呼吸機過程中由于機械張力的各種因素作用于肺組織引起的以肺泡結(jié)構(gòu)破壞、肺泡腔充血出血為病理特征的綜合征，臨床多表現(xiàn)為肺水腫及呼吸功能障礙。非生理性牽張除了通過機械剪切力破壞血氣功能屏障，使細胞膜通透性增加之外，還能激活體內(nèi)的炎癥信號通路，導(dǎo)致白細胞和各種促炎因子在損傷部位聚集，導(dǎo)致肺部產(chǎn)生炎癥應(yīng)答，啟動和加重肺組織損

2、傷。在機體非特異性免疫系統(tǒng)中NLRP3炎性蛋白及炎性體也發(fā)揮著重要功能，其中NLRP3蛋白能夠通過Toll樣受體4(TollLike Receptor4，TLR4)轉(zhuǎn)導(dǎo)入細胞中轉(zhuǎn)錄信號發(fā)生轉(zhuǎn)錄翻譯，生成增加并使炎性體聚合，最終通過蛋白水解作用將無活性的炎性因子前體pro-IL-1β轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒齑傺滓蜃覫L-1β并釋放至細胞外，引起機體的炎癥損傷，在NLRP3蛋白活化過程中線粒體來源的活性氧族(Reactive Oxygen Species

3、，ROS)起到了扳機作用，線粒體功能受損會導(dǎo)致線粒體膜電位（Mitochondria Membrane Potential，MMP）水平降低，發(fā)生ATP生成障礙、ROS異常生成增加等一系列后果，這些后果均會引起并加重體內(nèi)炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激。因此，本研究通過體內(nèi)試驗和體外試驗來研究NLRP3蛋白與線粒體功能在VILI發(fā)生發(fā)展過程中的變化。
　　研究方法:
　　體內(nèi)試驗:SPF級C57BL/6小鼠30只，8-10周齡，體重20-

4、25g，雌雄各半，隨機分配成3組(n=10):對照組（Conrol，C組），機械通氣組(MechanicalVentilation，MV組)，機械通氣+TLR4阻斷劑組(Mechanical Ventilation+TAK-242，MV+T組)。對C組小鼠做氣管切開后不進行氣管插管，自由通氣;MV組、MV+T組行機械通氣，RR=70次/min，VT=15ml/kg， I∶E）=1∶2，吸入氧濃度為21％，通氣時間為4h。MV+T組在麻醉

5、前用TLR4阻斷劑TAK-242(3mg/kg）預(yù)處理1h。機械通氣結(jié)束后，剪下右上肺放入EP管中，盡快使用液氮將其冷凍備用，后續(xù)蛋白免疫印跡法測NLRP3蛋白及NFκB-P65和磷酸化的NFκB-P65(NFκB-pP65);右肺下葉在4％多聚甲醛中固定48h后，進行HE染色;止血鉗鉗夾左側(cè)肺根，使用1ml注射器抽取預(yù)冷在4℃冰箱中的生理鹽水緩慢注入對肺組織，充分灌洗肺組織3次，0.3ml/次，并將灌洗液(BALF)注入凍存管中，盡快

6、放入-80℃保存，BALF用于檢測BALF中炎性因子IL-1β濃度。
　　體外試驗:單層培養(yǎng)MLE—12細胞，隨機分為4組:對照組（C組）、20％牽張組（CS組）、20％+TLR4阻斷劑組（CS+T組）以及線粒體電子傳遞鏈解偶聯(lián)劑cccp組（cccp組），CS組與CS+T組使用細胞牽張儀進行循環(huán)性牽拉，牽張儀參數(shù)設(shè)置為:0.5 Hz，牽張和放松的時間比:1∶1，牽張時間均為4小時，其中CS+T組行牽張前1h用TLR4阻斷劑TAK-

7、242(1uM)進行預(yù)處理。cccp組在后續(xù)進行實驗前30min用線粒體呼吸鏈解偶聯(lián)劑cccp(10uM)進行預(yù)處理。預(yù)處理及機械牽張結(jié)束后，每組留取等量細胞上清液置于凍存管迅速保存-80℃冰箱，用于檢測細胞上清液IL-1β濃度;提前準(zhǔn)備好冰袋，每組3孔細胞置于冰上提取蛋白總量，用于Western Blotting測NLRP3蛋白及NFκB-P65和磷酸化的NFκB-P65(NFκB-pP65)表達量;剩余細胞用JC-1法按照說明書處理

8、后用流式細胞儀檢測PE-A通道（紅）、FITV-A通道（綠）平均熒光強度和線粒體來源的ROS生成量。
　　結(jié)果:
　　體內(nèi)實驗:
　　1、HE染色發(fā)現(xiàn):大潮氣量機械通氣后小鼠肺泡細胞連接斷裂、肺泡壁增厚，肺泡腔內(nèi)充血出血，伴隨肺泡腔內(nèi)透明膜形成。使用TLR4阻斷劑后行大潮氣量機械通氣組肺泡腔內(nèi)充血、出血減少，肺泡壁斷裂、增厚均減少。
　　2、western blotting發(fā)現(xiàn)，與C組和MV+T組相比MV組NLR

9、P3蛋白和磷酸化的NFκ3-P65表達均增加，其中MV+T組NLRP3蛋白和磷酸化的NFκB-P65表達較C組增加，但較MV組減少。
　　3、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)發(fā)現(xiàn)，與C組IL-1β濃度相比，MV組和MV+T組炎性因子表達量顯著增加(P＜0.05)，其中MV+T組IL-1β濃度較MV組降低。
　　體外實驗:
　　1、western blotting發(fā)現(xiàn)，與C組相比，其余三組NLRP3蛋白和磷酸化的NFκB-

10、P65表達量均顯著增加，CS+T組NLRP3蛋白和NFκB-pP65表達量均降低，cccp組與CS組蛋白表達量無明顯差異。
　　2、流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，與C組相比，CS組、CS+T組和cccp組細胞MMP顯著下降，與CS組相比cccp組MMP水平無顯著差異，加入TLR4阻斷劑后行機械牽張，細胞MMP水平較CS組提高。
　　3、ELISA發(fā)現(xiàn)，IL-1β濃度在C組較其余三組低，與CS組相比，cccp組IL-1β濃度無明顯變化，