SIRT1通過線粒體自噬阻斷NLRP3炎癥小體活化和足細胞損傷.pdf

1、本文主要從以下幾方面進行論述：
　　第一部分 NLRP3炎癥小體在醛固酮誘導的足細胞損傷中的作用
　　目的:探討NLRP3炎癥小體活化在Aldo誘導的足細胞損傷中的作用。
　　方法:免疫組織化學染色檢測慢性腎臟病(MCD、FSGS)患兒腎組織中NLRP3的表達。體外培養(yǎng)小鼠足細胞系MPC5，應用不同濃度的Aldo(25、50、100、200 nM)刺激不同的時間(2、4、8、12、24、48 h)。體外應用NLRP3

2、siRNA轉(zhuǎn)染足細胞24h，加Aldo刺激，分為四組:陰性對照組(negative control，NC)、NC+Aldo組、NLRP3 siRNA組、NLRP3 siRNA+Aldo組。體外應用MnTBAP、CsA預處理足細胞30min，再加用Aldo刺激，分組如下:對照組、CsA組、Aldo組、CsA+Aldo組、MnTBAP組、MnTBAP+Aldo組。應用real-time PCR、westernblot及ELISA檢測足細胞N

3、LRP3炎癥小體活化后相關指標(NLRP3、IL-18及caspase-1)的表達。應用caspase-3、-8、-9試劑盒檢測三者的活性。體內(nèi)研究中，通過腹腔埋置滲透性微泵構(gòu)建Aldo腎損傷模型，分別于第1、3、5、7、14天處死小鼠;對NLRP3基因敲除(NLRP3-/-)小鼠亦通過腹腔埋置Aldo滲透性微泵模型，分為四組:野生型對照組、野生型加Aldo組、NLRP3-/-對照組、NLRP3-/-加Aldo組，于第14天處死小鼠，檢

4、測尿蛋白、肌酐、PAS染色后光鏡下腎組織病理學改變、電鏡下足細胞結(jié)構(gòu)改變，免疫熒光檢測腎組織中NLRP3的表達，應用real-time PCR及western blot檢測足細胞損傷指標nephrin和podocin。
　　結(jié)果:(1)免疫組化結(jié)果及NLRP3表達量的積分光密度統(tǒng)計值(IOD)顯示MCD和FSGS患者腎組織中NLRP3的表達明顯增高。原發(fā)性腎病綜合征患者尿液中IL-18表達較正常對照組明顯升高。(2) Real-t

5、ime PCR、western blot及ELISA結(jié)果顯示Aldo呈劑量依賴性地誘導足細胞NLRP3和IL-18的表達及分泌，Aldo50nM刺激24h時NLRP3和IL-18表達開始增加，200nM時達到高峰;Aldo亦呈時間依賴性地誘導NLRP3和IL-18的生成，Aldo100nM時刺激4h時IL-18的分泌即增加，且一直持續(xù)至24h。(3) Aldo灌注小鼠腎損傷模型結(jié)果顯示，Aldo灌注后第3天NLRP3表達開始增加（主要表

6、達在腎小球足細胞），第5天進一步升高并持續(xù)到14天，caspase-1在第7天時上升且14天時最為明顯，IL-18于第5天表達增加且持續(xù)到14天。Aldo灌注第5天nephrin表達開始下降（降低37％）且持續(xù)到第14天。(4) NLRP3 siRNA阻斷足細胞NLRP3炎癥小體的活化，并抑制Aldo誘導的caspase-1及IL-18表達，以及足細胞凋亡和nephrin表達下降;此外，NLRP3 siRNA亦阻斷了Aldo誘導的cas

7、pase-3、-8、-9活化。(5) NLRP3基因敲除可顯著抑制Aldo誘導的小鼠腎組織NLRP3炎癥小體活化，抑制腎小球體積增大和系膜增生，并降低蛋白尿。電鏡下Aldo灌注的野生型小鼠出現(xiàn)廣泛的足突融合，而NLRP3基因敲除小鼠幾乎保持著正常的足細胞形態(tài)。NLRP3基因敲除阻斷了Aldo對nephrin和podocin表達的抑制作用。(6)CsA可通過阻斷mPTP孔的開放，進而減輕Aldo引起的線粒體功能障礙，恢復線粒體膜電位及mt

8、DNA拷貝數(shù)。CsA同時抑制NLRP3炎癥小體的活化，降低NLRP3表達及炎癥因子IL-18釋放減少。與CsA作用相似，MnTBAP亦阻斷了NLRP3炎癥小體的活化。
　　結(jié)論:Aldo通過誘導線粒體功能障礙，進而活化NLRP3炎癥小體誘導足細胞損傷。
　　第二部分 SIRT1對NLRP3炎癥小體活化和炎癥因子表達的影響
　　目的:探討SIRT1對NLRP3炎癥小體活化和炎癥因子表達的影響。
　　方法:應用免疫組

9、化檢測慢性腎臟病(MN、MCD、FSGS)患兒腎組織中SIRT1的表達。體外培養(yǎng)小鼠足細胞系MPC5，應用SIRT1 siRNA轉(zhuǎn)染足細胞。分為三組:空白對照組(control，con)、空載對照組(vehicle，vehi)、SIRT1 siRNA組。應用SIRT1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染足細胞24h，加用Aldo刺激，分為四組:Vehi組、SIRT1過表達組、Vehi+Aldo組、SIRT1過表達+Aldo組。采用熒光探針2，7-二氯二氫熒光素乙酰

10、乙酸(2，7-dichlorofluorescein diacetate，DCHFDA)染料檢測細胞內(nèi)ROS水平;JC-1染色結(jié)合流式細胞術(shù)檢測線粒體膜電位;real-time PCR檢測mtDNA拷貝數(shù);AnnexinⅣ-PI雙染及流式細胞儀檢測足細胞凋亡情況;westernblot檢測足細胞nephrin、NLRP3的表達;應用caspase-3、-8、-9試劑盒分別檢測三者的活性。應用ELISA檢測炎癥因子IL-18的表達。體內(nèi)研

11、究中，應用NPHS2-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠與SIRT1flox/flox轉(zhuǎn)基因小鼠交配，制備足細胞條件性SIRT1基因敲除小鼠，即SIRT1flox/flox NPHS2cre(+)，對照組小鼠為SIRT1flox/flox NPHS2cre(-)。對SIRT1 flox/flox NPHS2cre(+)小鼠腹腔埋置Aldo滲透性微泵，分為四組:SIRT1 flox/floxNPHS2cre(-)對照組、SIRT1 flox/flox NP

12、HS2cre(-）+Aldo組、SIRT1 flox/flox NPHS2cre(+）對照組、SIRT1flox/flox NPHS2cre(+)+Aldo組。于第14天處死小鼠，檢測尿蛋白、肌酐、PAS染色觀察腎組織病理學改變、電鏡足細胞超微結(jié)構(gòu)改變，免疫熒光檢測腎組織中NLRP3及WT1的表達，real-time PCR和western blot檢測足細胞標志nephrin和podocin以及NLRP3活化指標NLRP3、caspa

13、se-1及IL-18的表達。
　　結(jié)果:(1)免疫組化結(jié)果顯示SIRT1在正常腎組織中高表達，在MN、MCD患兒腎組織中明顯降低，而在FSGS患者中幾乎不表達。(2)應用siRNA敲低SIRT1后，足細胞出現(xiàn)明顯的線粒體功能障礙，ROS產(chǎn)生增加，線粒體膜電位以及mtDNA拷貝數(shù)顯著下降。同時，足細胞凋亡明顯增多，caspase-3、caspase-9活性增加以及nephrin表達降低。敲低SIRT1亦顯著促進NLRP3表達及IL-

14、18的分泌。
　　結(jié)論:SIRT1可以阻斷Aldo誘導的線粒體功能障礙，抑制NLRP3炎癥小體活化，減輕足細胞損傷。
　　第三部分 BNIP3介導的線粒體自噬在SIRT1阻斷NLRP3炎癥小體活化中的作用
　　目的:探討B(tài)NIP3介導的線粒體自噬在SIRT1阻斷NLRP3炎癥小體活化中的作用。
　　方法:應用上述制備的足細胞條件性SIRT1基因敲除小鼠制備Aldo灌注模型，real-time PCR及wester

15、n blot檢測線粒體自噬相關基因(BNIP3、Beclin-1、Atg5及LC3)的表達。體外培養(yǎng)的足細胞轉(zhuǎn)染BNIP3質(zhì)粒24h后應用Aldo刺激，實驗分為四組:Vehi組、BNIP3過表達組、Vehi+Aldo組、BNIP3過表達+Aldo組。采用TUNEL檢測足細胞凋亡，real-time PCR及western blot檢測nephrin、podocin及NLRP3的表達，熒光探針MitoSOX檢測線粒體內(nèi)ROS水平，real

16、-time PCR檢測mtDNA拷貝數(shù)，JC-1染色結(jié)合流式細胞術(shù)檢測線粒體膜電位。
　　結(jié)果:(1)野生型小鼠Aldo灌注后BNIP3、Beclin-1和Atg5表達增加，而足細胞條件性SIRT1基因敲除小鼠抑制了BNIP3、Beclin-1和Atg5的表達，提示足細胞條件性敲除SIRT1基因抑制線粒體自噬。(2)BNIP3過表達后可阻斷Aldo誘導的足細胞凋亡，抑制nephrin、podocin表達下降。另外，BNIP3過表達