SIRT1調(diào)節(jié)線粒體自噬對豬腸上皮細胞氧化損傷的影響.pdf

1、腸道是應激反應的中心器官。當機體受內(nèi)外環(huán)境不利因素刺激時，極易導致腸道結(jié)構(gòu)及功能的損傷，誘發(fā)全身腸源性應激綜合征甚至危及生命，因此健康有序的腸道結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定對維持動物生長、發(fā)育、繁殖以及免疫功能具有重要意義。線粒體作為細胞呼吸和能量產(chǎn)生的重要場所，其內(nèi)膜呼吸鏈的氧化磷酸化是活性氧自由基(ROS)產(chǎn)生的主要來源，線粒體介導的選擇性自噬在降解受損或多余線粒體、維護線粒體數(shù)量和質(zhì)量的平衡以及細胞氧化損傷調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)沉默信息

2、調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)與線粒體自噬密切相關，并參與了細胞氧化損傷過程，但SIRT1調(diào)節(jié)線粒體自噬在腸道氧化損傷中的作用有待闡明。本研究主要探討SIRT1與豬腸上皮細胞線粒體自噬的關系，分析SIRT1對豬腸上皮細胞氧化損傷的影響，為闡明腸道氧化損傷的分子機理及抗氧化產(chǎn)品的研發(fā)提供思路與科學依據(jù)。
　　主要研究內(nèi)容:
　　1.氧化應激對豬腸上皮細胞氧化損傷、線粒體自噬及SIRT1/PGC-1α通路的影響
　　用濃度為30

3、0μM H2O2處理IPEC-1細胞12h，收取細胞樣品。分別用DCFH-DA與JC-1探針檢測細胞線粒體內(nèi)活性氧自由基水平及膜電位變化情況;qPCR和Western Blot分析腸黏膜緊密連接蛋白(ZO-1、Claudin-1和Occludin)、自噬標志分子（LC3、Beclin1和p62）、線粒體自噬通路(PINK1/Parkin)、SIRT1及其下游PGC-1α分子的表達變化。實驗結(jié)果顯示:(1)氧化應激導致豬腸上皮細胞ROS水

4、平增加、線粒體膜電位水平降低;腸黏膜屏障緊密連接分子mRNA和蛋白質(zhì)的表達受抑制;(2)線粒體自噬標志分子LC3、Beclin1、PINK1、Parkin的表達水平均顯著上調(diào)，而p62表達降低;(3)SIRT1及其下游PGC-1α分子的mRNA和蛋白表達水平均顯著降低。上述結(jié)果表明:氧化應激使豬腸上皮細胞遭受氧化損傷，導致線粒體膜電位下降，腸上皮細胞間緊密連接完整性被破壞，激活線粒體自噬水平，同時抑制SIRT1/PGC-1α信號通路分子

5、的表達。
　　2.SIRT1對豬腸上皮細胞線粒體自噬的影響
　　為進一步闡明SIRT1在豬腸上皮細胞線粒體自噬中的作用，首先利用不同濃度的SIRT1特異性小分子激活劑SRT1720（0μM、1.25μM、2.5μM、5μM）和抑制劑EX527(0μM、1μM、5μM、10μM、20μM)分別處理IPEC-1細胞，24h后提取RNA和蛋白質(zhì)，qPCR和Western Blot分析SIRT1及PGC-1α的表達水平，篩選激活劑及

6、抑制劑的最佳效應濃度;其次用該濃度處理細胞12h后加入300μMH2O2，12h后收集樣品，qPCR和Western Blot分析自噬標志分子LC3、ATG5及線粒體自噬PINK1/Parkin通路的表達情況。實驗結(jié)果顯示:(1)SIRT1/PGC-1α通路的表達水平隨激活劑SRT1720與抑制劑EX527濃度的增加呈現(xiàn)上調(diào)和下降趨勢，并于SRT1720濃度為1.25μM、EX527濃度為1μM時的激活和抑制效果最為顯著。(2)激活SI

7、RT1可增加線粒體自噬標志分子(LC3、ATG5)和PINK1/Parkin通路蛋白的表達水平，而抑制SIRT1時則出現(xiàn)相反效應。該結(jié)果表明，激活SIRT1后可進一步增強氧化應激誘導的豬腸上皮細胞線粒體自噬水平。
　　3.SIRT1對豬腸上皮細胞氧化損傷的影響
　　由于氧化應激導致豬腸上皮細胞黏膜屏障受損及線粒體膜電位水平降低，同時抑制了SIRT1分子的表達，并且SIRT1能激活線粒體自噬水平，但SIRT1是否參與豬腸上皮細

8、胞抗氧化損傷作用尚待進一步闡明。用SIRT1激活劑和抑制劑分別處理細胞，12h時加入300μM H2O2，12h后收集細胞樣品，分別用DCFH-DA與JC-1探針檢測細胞線粒體內(nèi)ROS水平及膜電位變化情況，qPCR和Western Blot分析腸黏膜緊密連接蛋白ZO-1、Claudin-1、Occludin基因及Claudin-1蛋白的表達情況。實驗結(jié)果顯示，在氧化應激狀態(tài)下激活SIRT1后，細胞內(nèi)ROS含量降低，線粒體膜電位水平升高，

9、緊密連接蛋白基因表達水平均明顯上調(diào)，而抑制SIRT1則出現(xiàn)相反效應。該結(jié)果表明:激活SIRT1可顯著逆轉(zhuǎn)豬腸上皮細胞的氧化損傷狀態(tài)，受抑制時則進一步加重損傷，SIRT1在豬腸道細胞應激過程中可發(fā)揮抗氧化應激的防御作用。
　　結(jié)論:
　　1.氧化應激導致豬腸上皮細胞氧化損傷:降低線粒體膜電位、破壞細胞間緊密連接完整性;激活細胞線粒體自噬水平;抑制SIRT1/PGC-1α信號通路分子的表達。
　　2.激活SIRT1可進一步