Sirt1通過血紅素氧化酶-1調(diào)控膿毒癥內(nèi)皮細胞自噬對凋亡的影響.pdf

1、第一部分:脂多糖干預對血管內(nèi)皮細胞凋亡和自噬的影響
　　目的:1、選擇合適的脂多糖濃度和干預時間復制膿毒癥內(nèi)皮細胞模型。2、明確脂多糖干預對內(nèi)皮細胞凋亡和自噬的影響。3、明確自噬對膿毒癥內(nèi)皮細胞凋亡的影響。
　　方法:第一步:體外培養(yǎng)臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)，給予不同濃度(0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、50μg/ml)和不同時間(0h、12h、24h、48h)脂多糖干預。用MTT法測定各組HUVEC相對存活

2、率。用ELISA法測定各組HUVEC培養(yǎng)液上清中TNF-α、IL-6、血管內(nèi)皮生長因子、脂聯(lián)素表達水平。用流式細胞儀檢測各組HUVEC凋亡率。用免疫熒光法檢測各組HUVEC自噬強度。根據(jù)細胞存活率、炎癥因子表達、凋亡率選擇合適的脂多糖濃度和干預時間復制膿毒癥細胞模型。第二步:在合適濃度和時間LPS干預HUVEC復制膿毒癥內(nèi)皮細胞模型基礎上，將HUVEC分為3組，分別為:對照組（0μg/mlLPS組）、LPS組和3-MA+LPS組（3-M

3、A為自噬抑制劑）。用MTT法測定LPS干預后各組HUVEC相對存活率。用小管形成實驗檢測各組HUVEC小管合圍長度和面積。用流式細胞儀檢測各組HUVEC凋亡率。用免疫熒光法檢測各組HUVEC自噬強度。用定量RT-PCR測定凋亡相關(guān)基因(caspase-3)和自噬相關(guān)基因(beclin-1、LC3B) mRNA相對表達量。用western-blot檢測凋亡相關(guān)蛋白(Caspase-3)和自噬相關(guān)蛋白(Beclin-1、LC3B)相對表達量

4、。各組計量資料以(Mean±SD)表示，采用SPSS18.0軟件進行One-Way ANOVA檢驗比較呈正態(tài)分布的多個獨立樣本均數(shù)，用Kruskal-Wallis H進行非正態(tài)分布的多個獨立樣本均數(shù)比較檢驗，用LSD-t檢驗進行正態(tài)分布的多樣本間均數(shù)的多重比較。P＜0.05認為組間差異有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果:
　　1、LPS干預HUVEC后存活率呈濃度和時間依賴模式下降。設對照組(0μg/ml LPS干預)HUVEC存活率

5、為1，LPS(5μg/ml)組:0.93±0.03,LPS(10μg/ml)組:0.84±0.03,LPS(50μg/ml)組:0.65±0.02。各不同濃度LPS干預組兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義;比較10μg/mlLPS干預培養(yǎng)HUVEC細胞不同時間點存活率，設0h組存活率為1，12h組:0.88±0.02，24h組:0.81±0.04，48h組:0.69±0.02。各時間點LPS干預組兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義。
　　2、LPS不

6、同濃度和不同時間點干預HUVEC細胞培養(yǎng)液上清TNF-α、IL-6和血管內(nèi)皮生長因子濃度與對照組（分別為0μg/mlLPS組和0h組）比較上升;LPS干預組HUVEC細胞培養(yǎng)液上清脂聯(lián)素濃度與對照組（分別為0μg/mlLPS組和0h組）比較下降。
　　3、LPS干預HUVEC細胞凋亡率(％)呈濃度和時間依賴模式增加。各濃度LPS組凋亡率分別為:對照組:3.68±0.14，LPS(5μg/ml)組:5.93±0.18，LPS(10μ

7、g/ml)組:11.57±0.23，LPS(50μg/ml)組:15.15±0.46。各濃度組間兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義;以10μg/ml LPS干預培養(yǎng)HUVEC細胞，各時間點凋亡率分別為:0h組:2.58±0.12，12h組:9.12±0.55，24h組:11.70±0.83，48h組:14.69±0.65。各時間點組間兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義。
　　4、LPS干預HUVEC細胞自噬強度隨濃度遞增呈低、中濃度上升、高濃度下降模

8、式變化。各LPS濃度組自噬強度分別為:對照組:60.78±2.00,LPS(5μg/ml)組:85.70±6.56,LPS(10μg/ml)組:133.96±4.8,LPS(50μg/ml)組:115.19±8.46。各濃度組間兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義;LPS干預HUVEC細胞自噬強度隨時間遞增呈先上升后下降趨勢。各時間點組自噬強度分別為:0h組:60.78±2.00，12h組:111.71±6.48，24h組:133.96±4.81，

9、48h組:96.49±6.74。各時間點組間兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義。
　　5、在合適濃度和時間LPS干預HUVEC復制膿毒癥內(nèi)皮細胞模型基礎上。以自噬抑制劑3-MA干預LPS刺激的HUVEC，觀察自噬抑制劑對膿毒癥內(nèi)皮細胞存活率、小管形成能力、凋亡率和自噬強度的影響。細胞存活率:設對照組存活率為1，LPS組:0.84±0.03，3-MA+LPS組:0.68±0.03。三組間兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義;各組內(nèi)皮小管合圍長度(μm)分

10、別為:對照組:47.06±2.66，LPS組:22.03±2.55，3-MA+LPS組;13.57±1.84。三組間兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義;各組內(nèi)皮小管合圍面積(μm2)分別為:對照組:113.03±5.47，LPS組:44.87±3.81，3-MA+LPS組:25.60±2.83。三組間兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義;各組細胞凋亡率(％)分別為:對照組:3.68±0.14，LPS組:11.57±0.23，3-MA+LPS組:14.19±0

11、.60。三組間兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義;各組自噬強度分別為:對照組;60.78±2.00，LPS組:133.96±4.81，3-MA+LPS組:80.43±4.39。三組間兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義;各組凋亡相關(guān)基因caspase-3mRNA相對表達量分別為:對照組:1.52±0.10，LPS組:6.05±0.92，3-MA+LPS組:8.01±1.17，三組間兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義;各組Caspase-3蛋白相對表達量分別為:對照組:

12、0.29±0.05，LPS組:0.90±0.02，3-MA+LPS組:1.10±0.02，三組間兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義;各組beclin-1 mRNA相對表達量分別為:對照組:1.38±1.02，LPS組:9.00±1.54，3-MA+LPS組:6.05±0.44，三組間兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義;各組Beclin-1蛋白相對表達量分別為:對照組:0.34±0.80，LPS組:1.38±0.57，3-MA+LPS組:1.05±0.90，

13、三組間兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義;各組LC3BmRNA相對表達量分別為:對照組:2.05±0.24，LPS組:7.00±0.90，3-MA+LPS組:6.06±0.59，三組間兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義;各組LC3B蛋白相對表達量分別為:對照組:0.90±0.07，LPS組:1.91±0.16，3-MA+LPS組:1.58±0.10，三組間兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)論:
　　1、10μg/ml脂多糖干預HUVEC24h可

14、以較好的模擬膿毒癥內(nèi)皮細胞炎癥反應和細胞凋亡反應。
　　2、脂多糖干預HUVEC后凋亡和自噬增加，自噬發(fā)揮細胞適應性保護作用。
　　3、抑制膿毒癥內(nèi)皮細胞自噬導致細胞凋亡增加。
　　第二部分:血紅素氧化酶-1對膿毒癥內(nèi)皮細胞凋亡和自噬的影響
　　目的:1、明確不同濃度脂多糖干預對HUVEC HO-1表達的影響。2、明確HO-1對膿毒癥內(nèi)皮細胞凋亡和自噬的影響。
　　方法:第一步:HUVEC分別與終濃度為0μ

15、g/ml、5μg/ml、10μg/ml、50μg/ml的含LPS的培養(yǎng)液中共孵育24h。以0μg/ml LPS干預HUVEC組為對照組，用定量RT-PCR檢測HUVEC HO-lmRN表達，用western-blot檢測HO-1蛋白表達。第二步:在合適濃度和時間LPS干預HUVEC復制膿毒癥內(nèi)皮細胞模型基礎上，用HO-1激動劑(hemin)、抑制劑(ZnPP)和自噬抑制劑(3-MA)聯(lián)合HO-1激動劑(hemin)分別預處理LPS干預的

16、HUVEC24h，以未干預培養(yǎng)的HUVEC為對照組，僅LPS干預的HUVEC為LPS組，HO-1激動劑hemin預處理LPS干預培養(yǎng)的HUVEC為hemin組，HO-1抑制劑ZnPP預處理LPS干預培養(yǎng)的HUVEC為ZnPP組，以3-MA聯(lián)合hemin預處理LPS干預培養(yǎng)的HUVEC為3-MA+hemin組。用MTT法檢測各組細胞存活率;用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率;免疫熒光法檢測各組自噬強度;用定量RT-PCR和Western-bl

17、ot方法分別檢測凋亡相關(guān)基因(caspase-3)和自噬相關(guān)基因(beclin-1和LC3B)mRNA和蛋白表達。各組計量資料以(Mean±SD)表示，采用SPSS18.0軟件進行One-Way ANOVA檢驗比較呈正態(tài)分布的多個獨立樣本均數(shù)，用Kruskal-Wallis H進行非正態(tài)分布的多個獨立樣本均數(shù)比較檢驗，用LSD-t檢驗進行正態(tài)分布的多樣本間均數(shù)的多重比較。P＜0.05認為組間差異有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果:
　

18、　1、定量RT-PCR和western-blot檢測不同濃度LPS干預的HUVECHO-1mRNA和蛋白表達。各組HO-1 mRNA相對表達量分別為:對照組:1.03±0.03,LPS(5μg/ml)組:1.21±0.07,LPS(10μg/ml)組:2.30±0.13,LPS(50μg/ml)組:2.31±0.12。各組HO-1蛋白相對表達量分別為:對照組:0.27±0.03,LPS(5μg/ml)組:0.46±0.01,LPS(10

19、g/ml)組:0.66±0.03,LPS(50μg/ml)組:0.68±0.03。比較各組HO-1 mRNA和蛋白相對表達量:與對照組比較，LPS(5μg/ml)組、LPS(10μg/ml)組和LPS(50μg/ml)組HO-1 mRNA和蛋白相對表達量增加，LPS(50μg/ml)組最高。LPS(10μg/ml)組與LPS(50μg/ml)組比較，HUVEC表達HO-1 mRNA和HO-1蛋白相對表達量比較差異無統(tǒng)計學意義。
　

20、　2、MTT法檢測各組細胞存活率。設對照組為1，其他各組細胞存活率均值分別為:LPS組:0.84±0.04，hemin組:0.93±0.06，ZnPP組:0.81±0.04，3-MA+hemin組:0.81±0.06。ZnPP組和3-MA+hemin組細胞存活率無顯著差異，其他各組間細胞存活率兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義。
　　3、用流式細胞儀檢測各組凋亡率(％)，各組細胞總凋亡率分別為:對照組:3.68±0.14，LPS組:13.

21、20±0.54，hemin組:9.20±0.36，ZnPP組:14.70±0.45，3-MA+hemin組:11.20±0.46。各組間細胞凋亡率的兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義。
　　4、用免疫熒光法檢測各組自噬強度，各組自噬強度均值分別為:對照組:76.06±4.14，LPS組:133.96±4.81，hemin組:206.82±2.11，ZnPP組:106.18±7.02，3-MA+hemin組:89.26±3.10。各組間細胞

22、自噬強度兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義。
　　5、定量RT-PCR和western-blot檢測各干預組的HUVECHO-1mRNA和蛋白相對表達量。各組HO-1mRNA相對表達量分別為:對照組:1.03±0.03，LPS組:2.31±0.31，hemin組:4.42±0.36，ZnPP組:1.29±0.11，3-MA+hemin組:4.30±0.20。各組HO-1蛋白相對表達量分別為:對照組:0.41±0.02，LPS組:0.77±

23、0.09，hemin組:1.49±0.07，ZnPP組:0.48±0.05，3-MA+hemin組:1.41±0.05。各組間HO-1 mRNA和蛋白相對表達量兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義。
　　6、定量RT-PCR和western-blot檢測各組HUVEC caspase-3mRNA和蛋白表達，各組caspase-3mRNA相對表達量分別為:對照組:1.52±0.09，LPS組:6.05±0.92，hemin組:3.02±0.4

24、6，ZnPP組:8.01±1.17，3-MA+hemin組:5.02±0.93。各組Caspase-3蛋白相對表達量分別為:對照組為:0.29±0.05，LPS組:0.87±0.07，hemin組:0.52±0.06，ZnPP組:1.10±0.02，3-MA+hemin組:0.69±0.05。各組間caspase-3mRNA和蛋白相對表達量兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義。
　　7、定量RT-PCR和western-blot檢測各組HU

25、VEC beclin-1mRNA和蛋白表達，各組beclin-1mRNA相對表達量分別為:對照組:1.05±0.03, LPS組:6.05±0.44, hemin組:9.00±1.54, ZnPP組:5.05±0.49，3-MA+hemin組:3.00±0.55。各組Beclin-1蛋白相對表達量分別為:對照組:0.34±0.08，LPS組為:1.05±0.09，hemin組:1.38±0.06，ZnPP組:0.82±0.04，3-MA

26、+hemin組:0.62±0.07。各組間beclin-1 mRNA和蛋白相對表達量兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義。
　　8、定量RT-PCR和western-blot檢測各組HUVEC LC3BmRNA和蛋白表達，各組LC3BmRNA相對表達量分別為:對照組:2.05±0.24，LPS組L:6.06±0.59, hemin組:7.00±0.90, ZnPP組:4.51±0.61,3-MA+hemin組:3.48±0.39。各組LC3

27、B蛋白相對表達量分別為:對照組:0.85±0.06， LPS組:1.58±0.10， hemin組:1.91±0.16， ZnPP組:1.40±0.06，3-MA+hemin組:1.11±0.06。各組間LC3B mRNA和蛋白相對表達量兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)論:
　　1、在一定濃度范圍內(nèi)，LPS干預可以呈劑量依賴模式促進HO-1表達。
　　2、HO-1參與調(diào)控膿毒癥內(nèi)皮細胞凋亡和自噬。
　　3、H

28、O-1通過促進膿毒癥內(nèi)皮細胞自噬抑制凋亡。
　　第三部分:sirt1對血紅素氧化酶-1調(diào)控膿毒癥內(nèi)皮細胞凋亡和自噬的影響
　　目的:1、明確膿毒癥內(nèi)皮細胞中sirt1對血紅素氧化酶-1的作用。2、明確sirt1對膿毒癥內(nèi)皮細胞凋亡和自噬的影響。
　　方法:第一步:通過生物信息網(wǎng)站查找sirt1基因序列，通過生物信息軟件構(gòu)建sirt1-siRNA套餐。細胞分為對照組(HUVEC正常培養(yǎng)組)、siRNA陰性片段組(siRN

29、A陰性片段轉(zhuǎn)染HUVEC組)和各候選sirt1-siRNA組（候選sirt1-siRNA轉(zhuǎn)染HUVEC組）。用定量RT-PCR和western-blot方法測定對照組、siRNA陰性片段組和各候選sirt1-siRNA組HUVEC中的sirt1-mRNA和蛋白相對表達量，選擇合適的sirt1-siRNA片段。比較24h和72h sirt1-siRNA轉(zhuǎn)染率(％)，選擇合適的轉(zhuǎn)染時間點。第二步:在合適濃度和時間LPS干預HUVEC復制膿毒

30、癥內(nèi)皮細胞模型、選擇最佳sirt1-siRNA片段和最佳轉(zhuǎn)染時間基礎上，實驗分為對照組(無干預HUVEC)、LPS組（膿毒癥內(nèi)皮細胞組）、sirt1-陰性片段組(sirt1陰性片段轉(zhuǎn)染膿毒癥內(nèi)皮細胞組)、sirt1-siRNA組(sirt1-siRNA轉(zhuǎn)染膿毒癥內(nèi)皮細胞組)、白藜蘆醇(sirt1激動劑)組（白藜蘆醇干預膿毒癥內(nèi)皮細胞組）。用MTT法測定各組細胞存活率;用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率;用免疫熒光法檢測自噬強度;用定量RT-

31、PCR和western-blot方法檢測各組HO-1、凋亡和自噬相關(guān)基因mRNA和蛋白相對表達量。各組計量資料以(Mean±SD)表示，采用SPSS18.0軟件進行One-Way ANOVA檢驗比較呈正態(tài)分布的多個獨立樣本均數(shù)，用Kruskal-Wallis H進行非正態(tài)分布的多個獨立樣本均數(shù)比較檢驗，用LSD-t檢驗進行正態(tài)分布的多樣本間均數(shù)的多重比較。P＜0.05認為組間差異有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果:
　　1、經(jīng)過生物信

32、息學軟件選擇含sirt1-siRNA-238、siRNA-1185、siRNA-2010和陰性片段組成的sirt1-siRNA套餐。合成陰性片段和各siRNA片段后轉(zhuǎn)染HUVEC24h，定量檢測各組HUVEC sirt1-mRNA相對表達量分別為:對照組:9.48±0.92，siRNA陰性片段組:9.52±1.14，siRNA-238組:1.03±0.03，siRNA-1185組:2.30±0.53，siRNA-2010組9.48±1.

33、34。定量檢測各組SIRT1蛋白相對表達量分別為:對照組:1.18±0.11，siRNA陰性片段組:1.17±0.11，siRNA-238組:0.34±0.04，siRNA-1185組:0.67±0.06，siRNA-2010組:1.08±0.07。比較各組相對表達量，顯示siRNA-238組sirt-1 mRNA和蛋白相對表達量最低，與實驗中其他各組比較差異有統(tǒng)計學意義。24h、72h點sirt1-siRNA-238轉(zhuǎn)染率(％)分別為

34、84.00±1.15，68.30±2.03。72h組與24h組轉(zhuǎn)染率比較顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義。
　　2、MTT法檢測細胞存活率:設對照組細胞存活率為1，LPS干預組:0.84±0.05，siRNA陰性片段組:0.82±0.03，sirt1-siRNA組:0.76±0.05，白藜蘆醇組:0.90±0.03。LPS干預組與siRNA陰性片段組細胞存活率無顯著性差異，余各組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義;
　　3、流式細胞儀檢

35、測各組凋亡率(％)分別為:對照組:3.62±0.08，LPS干預組:12.5±0.33，siRNA陰性片段組:12.68±1.07，sirt1-siRNA組:17.10±0.12，白藜蘆醇組:7.12±0.19。LPS干預組與siRNA陰性片段組細胞凋亡率無顯著性差異，余各組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義;
　　4、免疫熒光法檢測各組自噬強度分別為:對照組:72.06±3.54，LPS干預組:133.96±4.81，siRNA陰性片

36、段組:130.67±15.86，sirt1-siRNA組:105.88±8.29，白藜蘆醇組:185.38±10.76。LPS干預組與siRNA陰性片段組細胞自噬強度無顯著性差異，余各組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義;
　　5、定量RT-PCR檢測各組HUVEC HO-1 mRNA相對表達量分別為:對照組:1.07±0.06，LPS組:2.31±0.34，siRNA陰性片段組:2.80±0.27，sirt1-siRNA組:1.49±

37、0.09，白藜蘆醇組6.57±0.79。Western-blot法測定HO-1蛋白相對表達量分別為:對照組:0.51±0.08，LPS組:0.95±0.07，siRNA陰性片段組:0.94±0.08，sirt1-siRNA組:0.65±0.06，白藜蘆醇組:1.31±0.02。LPS干預組與siRNA陰性片段組HO-mRNA和蛋白的相對表達量均無顯著性差異，余各組間HO-mRNA和蛋白的相對表達量的兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義;
　

38、　6、定量RT-PCR檢測各組HUVEC caspase-3mRNA相對表達量分別為:對照組:1.52±0.10，LPS組:5.02±0.93，siRNA陰性片段組:5.18±0.78，sirt1-siRNA組:8.01±1.17，白藜蘆醇組:3.02±0.46。Westem-blot法測定Caspase-3蛋白相對表達量分別為:對照組:0.29±0.05，LPS組:0.62±0.03，siRNA陰性片段組:0.62±0.06，sirt

39、1-siRNA組:0.85±0.06，白藜蘆醇組:0.50±0.03。LPS干預組與siRNA陰性片段組caspase-3mRNA和蛋白相對表達量均無顯著性差異。余各組間caspase-3 mRNA和蛋白相對表達量兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義;
　　7、定量RT-PCR檢測各組beclin-1 mRNA相對表達量分別為:對照組:1.05±0.03，LPS組:5.05±0.49，siRNA陰性片段組:5.52±0.45，sirt1-s

40、iRNA組:3.00±0.55，白藜蘆醇組9.00±1.54。各組Beclin-1蛋白相對表達量分別為:對照組:0.34±0.08，LPS組:0.98±0.07，siRNA陰性片段組:1.05±0.08，sirt1-siRNA組:0.76±0.06，白藜蘆醇組:1.38±0.06。LPS干預組與siRNA陰性片段組beclin-1 mRNA和蛋白相對表達量比較均無顯著性差異。余各組間beclin-1 mRNA和蛋白的相對表達量兩兩比較差

41、異均有統(tǒng)計學意義;
　　8、各組LC3BmRNA相對表達量分別為:對照組:2.05±0.24，LPS組:4.51±0.61，siRNA陰性片段組:4.47±0.61，sirt1-siRNA組:3.48±0.39，白藜蘆醇組:7.00±0.90。各組LC3B蛋白相對表達量分別為:對照組:0.90±0.08，LPS組:1.58±0.10，siRNA陰性片段組:1.55±0.07，sirt1-siRNA組:1.18±0.08，白藜蘆醇組