Sirt1對豬肌內(nèi)脂肪前體細(xì)胞分化的影響及其機(jī)制初步研究.pdf

1、肌內(nèi)脂肪是決定豬肉品質(zhì)和風(fēng)味的重要因素，如何調(diào)控豬肌內(nèi)脂肪沉積進(jìn)而改善豬肉品質(zhì)是目前畜牧業(yè)面臨的關(guān)鍵科學(xué)問題之一。Sirt1是重要的細(xì)胞增殖分化因子，在脂肪細(xì)胞分化和脂肪代謝中具有重要作用。本研究以豬肌內(nèi)脂肪細(xì)胞為試驗(yàn)對象，利用Sirt1激動(dòng)劑、抑制劑及RNA干擾技術(shù)和超表達(dá)技術(shù)探究Sirt1對豬肌內(nèi)脂肪前體細(xì)胞分化和肌內(nèi)脂肪細(xì)胞脂肪分解的影響，進(jìn)一步通過基因芯片技術(shù)篩選肌內(nèi)脂肪前體細(xì)胞中Sirt1調(diào)控基因。主要研究結(jié)果如下:
　

2、　1.豬肌內(nèi)脂肪前體細(xì)胞的分離、鑒定及Sirt1超表達(dá)載體的構(gòu)建選取3頭5-7日齡仔豬，取背最長肌，利用差速貼壁法獲得豬肌內(nèi)脂肪前體細(xì)胞。結(jié)果顯示:分離得到的細(xì)胞形態(tài)正常。誘導(dǎo)培養(yǎng)后，油紅O染色、BODIPY染色結(jié)果表明細(xì)胞中有脂滴出現(xiàn)。PCR鑒定結(jié)果表明，脂肪前體細(xì)胞標(biāo)志基因PPARγ、 LPL、CEBPβ在細(xì)胞中均有表達(dá)。提示:豬肌內(nèi)脂肪前體細(xì)胞分離成功。同時(shí)，構(gòu)建了Sirt1超表達(dá)載體，將合成的Sirt1全長基因和pcDNA3.1

3、(+)表達(dá)載體進(jìn)行雙酶切，利用T4連接酶將酶切后的目的基因和表達(dá)載體進(jìn)行連接，雙酶切和測序結(jié)果表明，Sirt1超表達(dá)載體構(gòu)建成功。
　　2.Sirt1對豬肌內(nèi)脂肪前體細(xì)胞分化及肌內(nèi)脂肪細(xì)胞脂肪分解的影響在肌內(nèi)脂肪前體細(xì)胞中，50μM、100μM、200μM Sirt1抑制劑NAM處理細(xì)胞24小時(shí)，均不同程度抑制Sirt1 mRNA表達(dá)，細(xì)胞分化相關(guān)基因PPARγ、脂肪分解相關(guān)基因ATGL、HSL mRNA表達(dá)降低;同時(shí)，50μM、

4、100μM Sirt1激動(dòng)劑RES處理細(xì)胞24小時(shí)，50μM RES處理組與對照組基因表達(dá)差異不顯著，100μM RES顯著促進(jìn)Sirt1 mRNA表達(dá)，細(xì)胞分化相關(guān)基因PPARγ、脂肪分解相關(guān)基因ATGL、HSL mRNA表達(dá)升高。進(jìn)一步利用Sirt1干擾載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，處理24小時(shí)后，Sirt1 mRNA表達(dá)顯著降低(P＜0.01)，同時(shí)抑制PPARγ、ATGL、HSL mRNA表達(dá)(P＜0.01);Sirt1超表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞24小

5、時(shí)后，Sirt1 mRNA表達(dá)顯著升高(P＜0.01)，同時(shí)促進(jìn)PPARγ、ATGL、HSL mRNA表達(dá)(P＜0.01)。在成熟的肌內(nèi)脂肪細(xì)胞中，100μM NAM處理細(xì)胞24小時(shí)，抑制Sirt1 mRNA表達(dá)(P＜0.05)，PPARγ、ATGL、HSL mRNA表達(dá)降低(P＜0.05)。100μM RES處理細(xì)胞24小時(shí)，促進(jìn)Sirt1 mRNA表達(dá)(P＜0.01)，PPARγ、ATGL、HSL mRNA表達(dá)升高(P＜0.05)。

6、以上結(jié)果提示:Sirt1可以通過調(diào)控脂肪代謝因子PPARγ等的基因表達(dá)促進(jìn)肌內(nèi)脂肪前體細(xì)胞分化和肌內(nèi)脂肪細(xì)胞脂肪分解。
　　3.篩選肌內(nèi)脂肪前體細(xì)胞中Sirt1調(diào)控基因首先，用G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Sirt1干擾載體和超表達(dá)載體的細(xì)胞。利用Real-time PCR和Western blot檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的Sirt1 mRNA和蛋白表達(dá)水平。與陰性對照相比，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Sirt1干擾載體的細(xì)胞，Sirt1 mRNA表達(dá)顯著降低(P＜0

7、.01);與陰性對照相比，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Sirt1超表達(dá)載體的細(xì)胞，Sirt1 mRNA表達(dá)和蛋白水平顯著升高（P＜0.01）。提示:穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞篩選成功。在此基礎(chǔ)上，利用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Sirt1干擾載體和陰性對照載體的細(xì)胞進(jìn)行基因芯片分析，篩選得到差異表達(dá)2倍以上基因共154個(gè)，表達(dá)量升高基因76個(gè)，表達(dá)量降低基因78個(gè)，并且篩選得到PPAR通路及相關(guān)基因FABP3、LPL和SCD1，轉(zhuǎn)染Sirt1干擾載體后，F(xiàn)ABP3、LPL和SCD1基因表達(dá)

8、顯著降低(P＜0.01)，抑制脂肪細(xì)胞分化。同時(shí)，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Sirt1超表達(dá)載體和陰性對照載體的細(xì)胞進(jìn)行基因芯片分析，篩選出差異表達(dá)2倍以上基因共84個(gè)，表達(dá)量升高基因24個(gè)，表達(dá)量降低基因60個(gè)。并且，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Sirt1超表達(dá)載體后，F(xiàn)ABP3、aP2和SCD1等基因顯著升高（P＜0.05）。提示:Sirt1可能通過調(diào)控PPAR信號通路中基因的表達(dá)影響肌內(nèi)脂肪前體細(xì)胞分化。
　　綜上所述:在豬肌內(nèi)脂肪前體細(xì)胞和肌內(nèi)脂肪細(xì)胞中，Si