黑毛和牛肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞分化的基因表達(dá)與肌內(nèi)脂肪性能的關(guān)聯(lián)性研究.pdf

1、牛肉大理石紋(BeefMarbling)是沉積于肌束和肌纖維之間的一定量肌內(nèi)脂肪所呈現(xiàn)的外觀表現(xiàn)，即包括肌內(nèi)脂肪(Intramuscularfat，IMF)含量和分布，是衡量牛肉質(zhì)量等級的最關(guān)鍵指標(biāo)。作為大理石紋的物質(zhì)基礎(chǔ)，IMF直接參與肉質(zhì)嫩度、風(fēng)味和多汁性等性能的形成，是影響肉質(zhì)性狀與經(jīng)濟價值的最為重要因素。由于傳統(tǒng)肉質(zhì)選育方法無法進(jìn)行活體直接測定，選育成本高，進(jìn)度遲緩，利用DNA標(biāo)記篩選IMF性能的主效基因成為改進(jìn)IMF含量和脂肪

2、酸組成、提高肉質(zhì)性能的有效方法。本實驗以日本黑毛和牛為研究對象，采用添加含肥育牛血漿的成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基，檢測肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞分化過程中相關(guān)基因表達(dá)，并結(jié)合屠宰實驗分析這些基因表達(dá)水平與大理石紋等級(BeefMarblingStandard，BMS)、肌肉不飽和度(Unsaturatedfattyacids/Saturatedfattyacids，US/S)的相關(guān)性，篩選影響日本黑毛和牛肌內(nèi)脂肪沉積的候選基因，為進(jìn)一步探究肌內(nèi)脂肪沉積的機制

3、，改善肉品品質(zhì)提供理論依據(jù)。主要研究內(nèi)容如下:
　　 1.牛肌內(nèi)前體脂肪(Bovineintramuscularpreadipocyte，BIP)細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定
　　 采集3頭成年育肥日本黑毛黑牛第6-7肋間的肌肉，分離肌內(nèi)脂肪組織，利用膠原酶消化法分離獲得牛肌內(nèi)前脂肪細(xì)胞，體外培養(yǎng)，繪制生長曲線，誘導(dǎo)BIP細(xì)胞成脂分化，采用油紅O染色法和RT-PCR鑒定誘導(dǎo)所得細(xì)胞。結(jié)果顯示，分離培養(yǎng)的BIP細(xì)胞均一性良好，呈

4、梭形，貼壁生長，生長曲線呈“S”形，倍增時間43.3h;經(jīng)成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)8d，油紅0染色可見胞內(nèi)紅色脂滴，RT-PCR檢測顯示，BIP細(xì)胞表達(dá)GLUT-1，不表達(dá)GLUT-4，而誘導(dǎo)所得BIP細(xì)胞表達(dá)GLUT-1，GLUT-4的表達(dá)豐度較低。本實驗證明分離培養(yǎng)所得細(xì)胞具有BIP細(xì)胞形態(tài)和基因表達(dá)特性，為后續(xù)實驗奠定基礎(chǔ)。
　　 2.BIP細(xì)胞化過程中成脂基因的表達(dá)分析
　　 復(fù)蘇所得的凍存BIP細(xì)胞，傳代2-3次，利用含5

5、mM辛酸、50ng/mL胰島素、0.25mM地塞米松和10mM乙酸鈉的成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基定向誘導(dǎo)BIP細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞分化，收集誘導(dǎo)0、2、4、6、8d細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，采用實時熒光定量PCR方法檢測細(xì)胞分化過程中成脂基因的表達(dá)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)錄因子PPAR-γ和C/EBP-δ在誘導(dǎo)2d明顯大幅上調(diào)，其中，PPAR-γ于2d達(dá)到表達(dá)高峰，4d明顯回落，隨后維持穩(wěn)定略有升高趨勢;C/EBP-δ表達(dá)于4d達(dá)到最高水平，6d顯著下調(diào)，之后穩(wěn)

6、定略有升高。然而，SREBP-1表達(dá)水平呈一種基本穩(wěn)定略有下降趨勢，正常培養(yǎng)和成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)胞內(nèi)SREBP-1表達(dá)無顯著差異。脂肪合成相關(guān)酶基因FASN和SCD表達(dá)水平隨誘導(dǎo)培養(yǎng)呈”上升-下降-上升”趨勢，于8d出現(xiàn)最高表達(dá)。脂肪酸轉(zhuǎn)運相關(guān)基因aP2和CD36表達(dá)水平在分化前中期相似，即在誘導(dǎo)2d迅速表達(dá)，達(dá)到表達(dá)峰值，4d明顯下調(diào);在分化中后期，aP2表達(dá)逐漸升高，8d達(dá)到最高水平，而CD36維持穩(wěn)定略有升高趨勢。脂肪酸轉(zhuǎn)運基因之一

7、的FATP1處于相對穩(wěn)定略有下調(diào)狀態(tài)。本實驗結(jié)果表明，在分化早期以轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活為主，而中后期脂肪酸合成和跨膜轉(zhuǎn)運更活躍。此外，上述基因的表達(dá)模式可能存在種屬差異和細(xì)胞系差異。
　　 3.BIP細(xì)胞分化過程中成脂基因的表達(dá)水平與IMF性能的相關(guān)性分析
　　 選取源于日本東北部4個區(qū)域的47頭日本黑毛和牛，分別飼喂正常飼料和添加膨軟米的飼料，于肥育期(22月齡)采集血液樣本，制備血漿，用于配制47個誘導(dǎo)培養(yǎng)基。復(fù)蘇所得

8、的凍存BIP細(xì)胞，傳代2-3次，利用含2.5％肥育牛血漿和7.5％胎牛血清(Fetalbovineserum，F(xiàn)BS)的成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基，分別定向誘導(dǎo)BIP細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞分化，收集誘導(dǎo)8d細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，采用實時熒光定量PCR方法檢測細(xì)胞分化過程中成脂基因的表達(dá)。屠宰達(dá)到上市期(27-31月齡)的47頭實驗用牛，采集最長肌，按照日本牛肉質(zhì)量分級標(biāo)準(zhǔn)評定BMS，同時檢測肌內(nèi)脂肪酸組成，分析與誘導(dǎo)后BIP細(xì)胞內(nèi)成脂基因的相關(guān)性。結(jié)

9、果表明:屠宰時BMS分別與aP2(R=0.469)、SREBP-1(R=0.389)和PPAR-γ(R=0.533)的表達(dá)水平之間存在正相關(guān)，差異極顯著(P＜0.01)。屠宰時最長肌的US/S與SREBP-1表達(dá)量(R=0.398)呈現(xiàn)正相關(guān)，差異極顯著(P＜0.01)。基于肥育牛血漿來源進(jìn)一步分析，使用飼喂正常飼料的牛血漿，BMS與PPAR-γ表達(dá)(R=0.428)呈明顯正相關(guān)(P＜0.05)，最長肌的US/S與SREBP-1表達(dá)(R