絨山羊肌內(nèi)脂肪沉積特征及脂肪細(xì)胞分化機(jī)理的研究.pdf

1、肌內(nèi)脂肪含量是影響絨山羊肉品質(zhì)的一個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)，直接關(guān)系到絨山羊的經(jīng)濟(jì)價(jià)值與肉用價(jià)值。內(nèi)蒙古絨山羊膽固醇含量低、味美多汁，表現(xiàn)出優(yōu)良的肉品質(zhì)性狀。因此，本研究以內(nèi)蒙古白絨山羊?yàn)樵囼?yàn)動(dòng)物模型，探討不同部位肌肉組織中肌內(nèi)脂肪含量的沉積規(guī)律以及脂肪沉積代謝相關(guān)基因表達(dá)的變化特點(diǎn)，并在體外構(gòu)建絨山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞，進(jìn)行誘導(dǎo)分化，在細(xì)胞水平上對(duì)分化過程中成脂基因的表達(dá)模式進(jìn)行研究。利用RNAi技術(shù)在轉(zhuǎn)錄水平上初步鑒定PPARγ基因調(diào)控絨山羊脂肪沉

2、積的內(nèi)在機(jī)制。在此研究基礎(chǔ)上構(gòu)建肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞、成熟脂肪細(xì)胞、干擾組脂肪細(xì)胞和對(duì)照組脂肪細(xì)胞的RNA文庫(kù)，應(yīng)用IlluminaMiSeq測(cè)序技術(shù)對(duì)其進(jìn)行高通量測(cè)序，利用生物信息學(xué)軟件從測(cè)序評(píng)估、差異基因功能注釋、可變剪接等方面進(jìn)行分析，篩選調(diào)控脂肪沉積的關(guān)鍵基因。為肉用家畜肉質(zhì)性狀轉(zhuǎn)基因育種提供更為廣泛的基因來源。主要研究結(jié)果如下:
　　1、脂肪沉積關(guān)鍵基因在不同肌肉組織中的表達(dá)情況與IMF相關(guān)性分析PPARγ基因的表達(dá)具有組織

3、特異性，在膈肌、背最長(zhǎng)肌、胸下矩肌和股四頭肌中的表達(dá)量最高，極顯著的高于半腱肌、股二頭肌、腰大肌和腹外斜肌(P＜0.01)。其次在肋間肌和斜方肌中的表達(dá)量也較高。FTO基因的表達(dá)水平要明顯高于其他基因，在股四頭肌和斜方肌中的表達(dá)量極顯著高于其他部位，且兩者之間有顯著差異，背最長(zhǎng)肌和腹外斜肌等部位中的表達(dá)量較低。相反，lipin基因在不同肌肉組織中的表達(dá)量較低，膈肌和胸下矩肌中的表達(dá)量較高，其次是在肋間肌、股四頭肌和腰大肌，而腹外斜肌、背

4、最長(zhǎng)肌、半腱肌、斜方肌和股二頭肌中的表達(dá)量極低。LPL和HSL是脂肪合成和分解的關(guān)鍵酶類，其表達(dá)趨勢(shì)大致相同，僅僅在腰大肌和斜方肌這兩個(gè)部位的表達(dá)模式相反。A-FABP和Perilipin基因表達(dá)模式也較為特殊，整體表達(dá)量較低，組織之間無顯著差異，前者僅僅在胸下矩肌中有較高表達(dá)，后者是在股二頭肌?？傮w上看絨山羊PPARγ基因mRNA與肌內(nèi)脂肪呈負(fù)相關(guān);而其他成脂基因HSL、LPL、FTO、lipin、perilipin、A-FABP基因

5、mRNA與肌內(nèi)脂肪含量呈正相關(guān)。
　　2、絨山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞的構(gòu)建及分化過程中脂肪沉積關(guān)鍵基因的表達(dá)情況
　　采集1日齡絨山羊背最長(zhǎng)肌，利用Ⅱ膠原酶消化法分離獲得均一性良好，呈梭型的絨山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞。體外添加IBMX+DEX+INS，誘導(dǎo)細(xì)胞成脂分化，油紅O染色可見胞內(nèi)紅色脂滴。RT-PCR檢測(cè)脂肪沉積關(guān)鍵基因在前體脂肪細(xì)胞分化的早(D3)、中(D7)末(D11)三個(gè)時(shí)期，及誘導(dǎo)分化關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)(24h、48h、72

6、h、96h)的表達(dá)，其中FTO基因在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)顯著高于其他基因的表達(dá)水平;LPL、lipin、PPARγ、A-FABP和perilipin的表達(dá)模式相似，隨著前體脂肪細(xì)胞培養(yǎng)日齡的增加和甘油三酯的積聚，其表達(dá)量逐漸升高;LPL基因在脂肪細(xì)胞分化的早期表達(dá)量最高，之后表達(dá)量有所降低，但一直維持高表達(dá)量的趨勢(shì);PPARγ隨細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程其表達(dá)量也逐漸升高，48h表達(dá)水平最高;A-FABP基因同PPARγ表達(dá)模式一致;lipin基因在各個(gè)時(shí)

7、間點(diǎn)的表達(dá)豐度極低;HSL的表達(dá)量隨分化程度的升高而逐漸降低;perilipin基因僅僅在誘導(dǎo)分化的后期有較高表達(dá)。
　　3、沉默PPARγ基因?qū)χ炯?xì)胞增殖和分化的影響
　　為了證明PPARγ基因在脂肪細(xì)胞分化過程中的重要作用。本研究首次構(gòu)建山羊shRNA-PPARγ慢病毒干擾載體，對(duì)肌內(nèi)脂肪細(xì)胞的感染效率為80％，熒光定量和Western blot檢測(cè)慢病毒載體介導(dǎo)的shRNA可以有效的降低PPARγ的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其mRN

8、A水平和蛋白水平的作用時(shí)間相隔24h。沉默PPARγ基因后脂肪細(xì)胞內(nèi)甘油三酯濃度明顯低于對(duì)照組脂肪細(xì)胞，表明其分化能力顯著降低;通過MTT檢測(cè)，干擾組細(xì)胞較對(duì)照組細(xì)胞增殖能力反而增強(qiáng)。其他脂肪細(xì)胞分化的相關(guān)基因LPL、FTO、A-FABP和perilipin基因的表達(dá)量隨著PPARγ基因表達(dá)量的下調(diào)出現(xiàn)不同程度的降低，而HSL和lipin基因未檢測(cè)到明顯變化。由此可見PPARγ基因在脂肪細(xì)胞分化過程的調(diào)控中心位置，發(fā)揮著調(diào)控其他基因表達(dá)

9、的關(guān)鍵作用。
　　4、肌內(nèi)脂肪細(xì)胞成熟前后、干擾前后比較轉(zhuǎn)錄組分析
　　本研究基于RNA-seq高通量測(cè)序技術(shù)，得到16G表達(dá)譜數(shù)據(jù)，通過TopHat軟件對(duì)肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞、成熟脂肪細(xì)胞，shRNA-PPARγ脂肪細(xì)胞和對(duì)照組脂肪細(xì)胞4個(gè)樣本兩兩比對(duì)篩選到表達(dá)量差異4倍以上的基因分別為152、450、456、412、39和445個(gè)，其中pref-1、FGF、TGF、TNF、RA、IL-21B和EGF等抑制脂肪沉積的基因在sh

10、RNA-PPARγ干擾組肌內(nèi)脂肪細(xì)胞中有較高表達(dá)。對(duì)這些差異基因進(jìn)行GO分類和KGEE通路的初步分析，富集到與脂肪細(xì)胞分化有關(guān)的10條通路，差異最為顯著的是PPARγ信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路、mTOR信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路。其中有六個(gè)基因LPL、FABP、FATP、AP2、RXRG和CD36富集到了PPARγ信號(hào)通路中，它們?cè)诔墒熘炯?xì)胞中的表達(dá)量顯著高于前體脂肪細(xì)胞，這與在細(xì)胞基礎(chǔ)上的研究結(jié)果一致，表明這些基因可作為絨山羊肌內(nèi)脂肪