豬肌內(nèi)脂肪沉積關(guān)鍵基因的篩選及其新基因pFLJ的功能鑒定.pdf

1、肌內(nèi)脂肪含量是影響豬肉品質(zhì)的一個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)，不僅影響豬肉的色澤、風(fēng)味和嫩度，同時(shí)對(duì)豬肉的保水力也有重要影響，我國地方優(yōu)良地方品種豬金華豬肌內(nèi)脂肪含量高、肉色紅潤，與外來品種長白豬相比，表現(xiàn)出優(yōu)良的肉品質(zhì)性狀。因此，本研究以金華豬和長白豬為試驗(yàn)動(dòng)物模型，在比較兩品種豬胴體性狀及肉質(zhì)差異的基礎(chǔ)上，通過基因芯片技術(shù)、生物信息學(xué)分析技術(shù)獲得金華豬和長白豬背最長肌基因差異表達(dá)譜，并通過半定量和實(shí)時(shí)熒光定量驗(yàn)證基因芯片數(shù)據(jù)的可靠性。進(jìn)一步通過RACE

2、克隆技術(shù)克隆得到調(diào)控豬肌內(nèi)脂肪沉積的新基因pFLJ的cDNA全長，并利用RNAi技術(shù)和基因超表達(dá)技術(shù)在轉(zhuǎn)錄水平上初步鑒定pFLJ基因調(diào)控豬肌內(nèi)脂肪沉積的內(nèi)在機(jī)制。主要的研究結(jié)果如下:
　　 實(shí)驗(yàn)一金華豬和長白豬胴體性狀及肉質(zhì)的比較研究
　　 分別選取胎次相同、體重均一的純種金華豬和純種長白豬在同一飼養(yǎng)條件下飼喂相同營養(yǎng)水平的日糧，分別在30、60、90、120、150日齡時(shí)進(jìn)行屠宰測定及背最長肌樣品采集。1）胴體性狀研究

3、結(jié)果表明，從30到150日齡，金華豬增重約40kg，而長白豬增重70kg，這表明金華豬生長速度明顯低于長白豬。與長白豬相比，金華豬瘦肉率在30、60、90、120、150日齡均顯著低于長白豬(p＜0.05)，眼肌面積呈現(xiàn)相同趨勢(shì);脂肪率在30、60、90、120、150日齡均顯著高于長白豬(p＜0.05)，150日齡時(shí)，金華豬脂肪率達(dá)32.4％，比長白豬(13.3％)高2.4倍以上(p＜0.05)，背膘厚品種差異與脂肪率呈現(xiàn)相同趨勢(shì)，并

4、且150日齡時(shí)金華豬背膘厚（23.7mm）是長白豬（12mm）的2倍以上。2）肉品質(zhì)性狀結(jié)果表明，金華豬肌內(nèi)脂肪含量均高于長白豬，90日齡后出現(xiàn)顯著高于長白豬(p＜0.05)，并且金華豬在60(1.48％)、90(2.25％)，120(3.20％)和150(3.38％)日齡階段肌內(nèi)脂肪含量呈現(xiàn)穩(wěn)定增加趨勢(shì)，長自豬中肌內(nèi)脂肪含量在60(1.13％)、90(1.28％)、120(1.31％)和150(1.79％)日齡階段呈現(xiàn)穩(wěn)步增加趨勢(shì)，而

5、從30日齡到150日齡階段相對(duì)金華豬肌內(nèi)脂肪含量增加幅度較小，提示金華豬擁有更優(yōu)于長白豬的肌內(nèi)脂肪沉積能力;與長白豬相比，金華豬滴水損失低于長白豬，肉色L*值高于長白豬;以上結(jié)果進(jìn)一步揭示所選模型金華豬雖然生長速度慢，但肉質(zhì)較長白豬更為優(yōu)良，且在90日齡后金華豬肌內(nèi)脂肪含量顯著高于長白豬，因此本實(shí)驗(yàn)為實(shí)驗(yàn)二的開展肉質(zhì)內(nèi)在調(diào)控基因的挖掘提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物樣品。
　　 實(shí)驗(yàn)二金華豬和長白豬背最長肌基因表達(dá)譜差異研究
　　

6、 利用基因芯片技術(shù)、生物信息學(xué)分析技術(shù)研究了實(shí)驗(yàn)一所采集的30、90、150日齡金華豬和長白豬背最長肌的基因表達(dá)差異。1）不同日齡階段基因表達(dá)譜差異研究結(jié)果顯示，與30日齡相比，90日齡金華豬背最長肌顯著高表達(dá)基因有177個(gè)，顯著低表達(dá)的基因有242個(gè)，150日齡金華豬背最長肌顯著高表達(dá)基因有101個(gè)，顯著低表達(dá)的基因有389個(gè);與30日齡相比，90日齡長白豬背最長肌顯著高表達(dá)基因有106個(gè)，顯著低表達(dá)的基因有231個(gè)，150日齡長白

7、豬背最長肌顯著高表達(dá)基因有93個(gè)，顯著低表達(dá)的基因有383個(gè);2）兩品種豬背最長肌中基因表達(dá)差異分析結(jié)果顯示，與長白豬相比，30日齡金華豬背最長肌中顯著高表達(dá)基因有176個(gè)，顯著低表達(dá)基因有199個(gè)，90日齡金華豬背最長肌中顯著高表達(dá)基因有276個(gè)，顯著低表達(dá)基因有155個(gè)，150日齡金華豬背最長肌中顯著高表達(dá)基因有525個(gè)，顯著低表達(dá)基因有670個(gè)。3）兩品種豬背最長肌中基因表達(dá)規(guī)律類似度比較結(jié)果顯示，與30日齡相比，90日齡中金華豬

8、和長白豬均高表達(dá)和低表達(dá)的基因的類似度分別為0.7％和1.7％;150日齡中金華豬和長白豬均高表達(dá)和低表達(dá)的基因的類似度分別為3.2％和7.9％，該研究結(jié)果揭示金華豬和長白豬在相同日齡條件下，肌纖維生長和發(fā)育及肌內(nèi)脂肪沉積的內(nèi)在機(jī)制存在顯著差異。
　　 將上述獲得的差異表達(dá)基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果顯示，金華豬與長白豬背最長肌中差異表達(dá)基因主要有肌纖維生成與發(fā)育相關(guān)基因或轉(zhuǎn)錄因子、脂肪代謝相關(guān)基因和轉(zhuǎn)錄因子。提示肌纖維生成和發(fā)

9、育以及脂肪代謝相關(guān)基因或轉(zhuǎn)錄因子可能是調(diào)控兩品種豬肌內(nèi)脂肪沉積差異的關(guān)鍵因素。進(jìn)一步通過實(shí)時(shí)熒光定量和半定量PCR法雙重驗(yàn)證了基因芯片數(shù)據(jù)的可靠性，結(jié)果顯示，實(shí)時(shí)熒光定量PCR、半定量PCR結(jié)果均與基因芯片結(jié)果相一致，提示通過本實(shí)驗(yàn)所獲得的芯片結(jié)果可靠性強(qiáng);綜上所述，高通量的差異基因的獲得為后續(xù)研究豬肌內(nèi)脂肪沉積內(nèi)在分子機(jī)制提供科學(xué)可靠的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
　　 實(shí)驗(yàn)三豬肌內(nèi)脂肪沉積關(guān)鍵新功能基因pFLJ的篩選、cDNA全長克隆及序列分

10、析
　　 根據(jù)上述通過基因芯片技術(shù)獲得的差異基因列表，基因芯片數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，EST序列編號(hào)為BI184304的基因在90日齡時(shí)，其表達(dá)水平金華豬顯著高于長白豬，倍數(shù)高達(dá)9倍以上，且在皮下脂肪組織中兩豬種差異不顯著，實(shí)時(shí)熒光定量研究結(jié)果與芯片研究結(jié)果相一致。進(jìn)一步利用實(shí)時(shí)熒光定量法研究了其在金華豬中的組織特異性，結(jié)果顯示其在肌肉中表達(dá)最高，在腦組織中次之;不同生長階段金華豬背最長肌中EST序列編號(hào)為BI184304的基因表達(dá)規(guī)律結(jié)

11、果顯示，伴隨著肌內(nèi)脂肪沉積的增加呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，且與金華豬肌內(nèi)脂肪在90日齡出現(xiàn)顯著高于長白豬的趨勢(shì)一致。推測，EST序列編號(hào)為BI184304的基因可能是參與豬肌內(nèi)脂肪調(diào)控的關(guān)鍵基因。因此，將其作為后續(xù)研究豬肌內(nèi)脂肪沉積的候選基因。
　　 為研究上述篩選獲得的候選基因功能，根據(jù)已知的EST序列，通過RACE技術(shù)，克隆得到EST序列編號(hào)為BI184304的基因全長cDNA序列，基因全長cDNA序列有2793bp，其中包括283 b

12、p5'非編碼區(qū)(5'-untranslated region，5'-UTRs)、714 bp編碼區(qū)(coding region，CDs)和1796 bp的3'非編碼區(qū)(3'-UTR)，編碼區(qū)翻譯237個(gè)氨基酸;BLAST結(jié)果表明，氨基酸序列序列與人、鼠FLJ基因同源性分別達(dá)到99％，84％，因此將此基因命名為豬FLJ基因即為porcine FLJ(pFLJ)。pFLJ基因cDNA全長基因的克隆為后續(xù)研究pFLJ基因的功能奠定分子生物學(xué)基

13、礎(chǔ)。
　　 實(shí)驗(yàn)四pFLJ對(duì)肌內(nèi)脂肪沉積的影響及調(diào)控機(jī)制研究
　　 為研究pFLJ基因的功能，本實(shí)驗(yàn)通過差速貼壁法建立了豬肌內(nèi)脂肪細(xì)胞體外培養(yǎng)模型，以此肌內(nèi)脂肪細(xì)胞培養(yǎng)模型為實(shí)驗(yàn)對(duì)象開展研究，主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　 為初步探索pFLJ基因的功能，本實(shí)驗(yàn)首先研究了豬肌內(nèi)脂肪細(xì)胞不同分化階段的脂滴沉積規(guī)律、pFLJ基因及脂肪分解關(guān)鍵基因ATGL和HSL基因的表達(dá)規(guī)律，研究結(jié)果表明:豬肌內(nèi)脂肪細(xì)胞中，F(xiàn)LJ的基因表達(dá)

14、隨著細(xì)胞的分化而在第4d后逐漸升高，與脂肪分解關(guān)鍵基因ATGL和HSL基因逐漸降低這一規(guī)律呈相反趨勢(shì)，與脂滴沉積增加規(guī)律呈顯著正相關(guān);其次利用本課題組已有的經(jīng)典脂肪沉積抑制劑SR141716處理豬肌內(nèi)脂肪細(xì)胞，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著SR141716添加濃度的增加，與對(duì)照組相比，pFLJ基因表達(dá)顯著降低;進(jìn)一步利用能顯著提高肌內(nèi)脂肪沉積、改善肉質(zhì)的營養(yǎng)因素CLA處理豬肌內(nèi)脂肪細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著CLA添加濃度的增加，與對(duì)照組相比，pFLJ基因

15、mRNA水平顯著提高(p＜0.05)，同時(shí)能顯著提高脂肪合成關(guān)鍵酶FAS基因mRNA水平，同時(shí)增加了豬肌內(nèi)脂肪細(xì)胞中甘油三酯的含量(p＜0.05)。因此，綜合前述金華豬和長白豬品種比較和表達(dá)規(guī)律研究結(jié)果，推測FLJ基因可能是正調(diào)控肌內(nèi)脂肪沉積的關(guān)鍵功能基因.
　　 為證明上述推論，首先通過RNAi技術(shù)，篩選獲得了FLJ基因的有效siRNA表達(dá)載體fs1，經(jīng)干擾條件優(yōu)化后的干擾效果達(dá)到70.9％。轉(zhuǎn)染fs1干擾FLJ基因表達(dá)后，顯

16、著降低了脂肪合成關(guān)鍵基因FAS和ACC基因的表達(dá)(p＜0.05)，但同時(shí)也顯著降低了脂肪分解關(guān)鍵基因ATGL和HSL基因的表達(dá)(p＜0.05)，降低了培養(yǎng)基中甘油的含量。進(jìn)一步的CLA與干擾FLJ基因表達(dá)協(xié)同作用結(jié)果表明，與CLA添加實(shí)驗(yàn)組相比， CLA與干擾FLJ基因表達(dá)協(xié)同作用實(shí)驗(yàn)組的豬肌內(nèi)脂肪細(xì)胞中脂肪合成關(guān)鍵基因FAS顯著降低(p＜0.05)，脂肪細(xì)胞中的脂滴沉積也顯著降低(p＜0.05)。以上研究提示，抑制FLJ基因表達(dá)后，不

17、僅降低了脂肪合成代謝關(guān)鍵功能基因表達(dá)(p＜0.05)，同時(shí)也降低了脂肪分解代謝關(guān)鍵功能基因表達(dá)(p＜0.05)，同時(shí)，干擾pFLJ基因的表達(dá)抑制了外源性脂肪酸對(duì)肌內(nèi)脂肪細(xì)胞中脂滴的沉積的正調(diào)控作用。提示，pFLJ基因可能是參與外源脂肪酸調(diào)控肌內(nèi)脂肪細(xì)胞中脂滴沉積的關(guān)鍵基因。
　　 為進(jìn)一步驗(yàn)證上述推論，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了豬FLJ基因的熒光超表達(dá)載體，經(jīng)超表達(dá)條件優(yōu)化后轉(zhuǎn)染pEGFP-FLJ超表達(dá)FLJ基因表達(dá)后，升高了脂肪合成關(guān)鍵基因

18、FAS和ACC基因和脂肪分解關(guān)鍵基因ATGL和HSL基因的表達(dá)，與前述干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。CLA與pEGFP-FLJ超表達(dá)FLJ基因協(xié)同作用結(jié)果顯示，與CLA處理組相比，CLA和超表達(dá)FLJ基因協(xié)同處理肌內(nèi)脂肪細(xì)胞，極顯著增加了脂肪合成代謝關(guān)鍵功能基因FAS基因的表達(dá)(p＜0.01)，對(duì)脂肪分解關(guān)鍵功能基因ATGL等表達(dá)有升高趨勢(shì)，同時(shí)顯著增加了脂肪細(xì)胞中甘油三酯的沉積(p＜0.05)，降低了培養(yǎng)基中甘油的含量。上述pFLJ超表達(dá)結(jié)果進(jìn)

19、一步揭示，超表達(dá)pFLJ基因后，不僅降低了脂肪合成代謝關(guān)鍵功能基因表達(dá)，同時(shí)也降低了脂肪分解代謝關(guān)鍵功能基因表達(dá)，同時(shí)，超表達(dá)pFLJ基因能夠顯著有效地增強(qiáng)外源性脂肪酸對(duì)肌內(nèi)脂肪細(xì)胞中脂滴沉積的正調(diào)控作用。
　　 綜上所述，本研究在比較金華豬和長白豬肉品質(zhì)的基礎(chǔ)上，獲得了金華豬和長白豬30、90、150日齡背最長肌中基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜，所篩選獲得的差異表達(dá)基因?yàn)楹罄m(xù)通過營養(yǎng)或基因手段調(diào)控肌內(nèi)脂肪沉積提供重要的理論依據(jù)，在此數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上