豬背最長(zhǎng)肌差異表達(dá)基因的克隆鑒定及其特征分析.pdf

1、骨骼肌是動(dòng)物體內(nèi)最豐富的組織，占肉用動(dòng)物體重的45％～60％，其生長(zhǎng)發(fā)育是肉用家畜最重要的性狀之一。不同豬種由于來(lái)源、長(zhǎng)期所處的地理環(huán)境以及所接受的飼養(yǎng)方式和選育性狀重點(diǎn)的不同，從而形成了各自的種質(zhì)特性，使其在肌肉相關(guān)性狀方面存在較大的差異。兩個(gè)具有不同性狀的親本雜交產(chǎn)生的雜種在肌肉生長(zhǎng)、肌肉品質(zhì)等方面也往往超過(guò)其雙親，產(chǎn)生雜種優(yōu)勢(shì)的現(xiàn)象。隨著人們對(duì)基因結(jié)構(gòu)和功能的研究深入，人們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到這些差異及雜種優(yōu)勢(shì)現(xiàn)象應(yīng)是基因差異表達(dá)的結(jié)果。所

2、以本研究以豬背最長(zhǎng)肌為材料，利用抑制消減雜交技術(shù)構(gòu)建了不同豬種(長(zhǎng)白與梅山)以及豬雜交親代與子代(大白與長(zhǎng)大)背最長(zhǎng)肌間的正反向消減cDNA文庫(kù)，進(jìn)行了差異表達(dá)基因的篩選、克隆和鑒定，取得了如下結(jié)果： 1.以管家基因G3PDH作為消減指標(biāo)，對(duì)每個(gè)消減文庫(kù)的消減效率進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明4個(gè)消減文庫(kù)的消減效率都達(dá)25倍以上，有的甚至高達(dá)210倍，這同時(shí)也表明了某些特異于兩種肌肉組織的差異表達(dá)基因的富集效率也達(dá)25倍以上，說(shuō)明所構(gòu)建的

3、消減cDNA文庫(kù)質(zhì)量很好。 2.從以梅山豬為T(mén)ester、長(zhǎng)白豬為Driver和以雜交母本大白豬為T(mén)ester、雜種F1長(zhǎng)大豬為Driver的消減cDNA文庫(kù)中我們分別隨機(jī)挑取了800多個(gè)克隆。利用PCR技術(shù)進(jìn)行鑒定，分別獲得了759和773個(gè)有效陽(yáng)性克隆，插入片段長(zhǎng)度主要分布于150～750bp之間。 3.利用正向消減cDNA、反向未消減cDNA、反向消減cDNA作探針對(duì)兩消減cDNA文庫(kù)中的陽(yáng)性克隆進(jìn)行了高通量篩選。

4、在以梅山豬為T(mén)ester、長(zhǎng)白豬為Driver的消減cDNA文庫(kù)中，我們選取了27個(gè)差異表達(dá)克隆進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)共代表14個(gè)ESTs,4個(gè)在豬中為已知基因，10個(gè)在豬中為未知基因，其中7個(gè)與人等其他物種的基因有高同源性，3個(gè)未找到明顯的同源性。在以雜交母本大白豬為T(mén)ester、雜種F1長(zhǎng)大豬為Driver的消減cDNA文庫(kù)中，我們選取了24個(gè)差異克隆進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)共代表12個(gè)ESTs，5個(gè)在豬中為已知基因，7個(gè)在豬中為未知基因，但分別與人

5、等其他物種的基因有高的同源性。并利用含內(nèi)標(biāo)化的半定量RT-PCR技術(shù)進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果表明大部分為差異表達(dá)。 4.將電腦克隆和SMART技術(shù)相結(jié)合，成功克隆了7個(gè)差異表達(dá)全長(zhǎng)基因：(1)CCNG1，GenBank登錄號(hào)為AY974246，cDNA全長(zhǎng)2359bp，ORF為888bp；(2)EEF1A，cDNA全長(zhǎng)1777bp，ORF為1389bp；(3)ETFB-like，cDNA全長(zhǎng)898bp，ORF為765bp；(4)HUMM

6、LC2B，GenBank登錄號(hào)為AY754870，cDNA全長(zhǎng)681bp，ORF為510bp；(5)PGK1，GenBank登錄號(hào)為AY677198，cDNA全長(zhǎng)1789bp，ORF為1254bp；(6)TXNIP，cDNA全長(zhǎng)1880bp，ORF為1176bp；(7)CKM，GenBank登錄號(hào)為AY754869，cDNA全長(zhǎng)1572bp，ORF為1146bp。其中，CCNG1、EEF1A、ETFB-like在梅山豬中高表達(dá)，HUMM

7、LC2B、PGK1、TXNIP、CKM在雜交母本大白豬中高表達(dá)，在雜種F1長(zhǎng)大豬中低表達(dá)或不表達(dá)。 5.利用CLUSTALw等軟件對(duì)豬CCNG1、EEF1A、ETFB-like、HUMMLC2B、PGK1、TXNIP、CKM基因結(jié)構(gòu)、所編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能、系統(tǒng)進(jìn)化等特征進(jìn)行了預(yù)測(cè)和分析，并進(jìn)行了分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建。 6.利用含內(nèi)標(biāo)化的半定量RT-PCR技術(shù)對(duì)所獲得的差異基因進(jìn)行了不同品種間(大白、長(zhǎng)白、梅山、杜洛克

8、、通城、長(zhǎng)大、大梅、梅大)、不同發(fā)育階段間(胚胎、初生、二月齡、四月齡、六月齡)、不同組織類型間(心、肝、脾、肺、腎、胰、小腸、卵巢、睪丸、胃、子宮、脂肪、股二頭肌、半棘肌、背最長(zhǎng)肌)的時(shí)空特異性表達(dá)分析，這些基因的表達(dá)特異性可能與其功能密切相關(guān)。 7.利用PCR-Walking技術(shù)，擴(kuò)增了其中3個(gè)基因的全部?jī)?nèi)含子序列和其他基因的部分基因組序列，并分析了其在不同豬種中的多態(tài)性：(1)CCNG1，7491bp，包含6個(gè)內(nèi)含子和7個(gè)

9、外顯子。在全序列中，發(fā)現(xiàn)了23個(gè)SNP位點(diǎn)，顛換突變4個(gè)，轉(zhuǎn)換突變17個(gè)，插入突變1個(gè)，缺失突變1個(gè)。另外，在陽(yáng)新豬CCNG1的第二內(nèi)含子上還存在一個(gè)21bp的“AATGAATCTGTGTACTGAATC”插入。(2)HUMMLC2B，2936bp，GenBank登錄號(hào)為AY870651，包含6個(gè)內(nèi)含子和7個(gè)外顯子。在外顯子4到外顯子7(包括部分第4、7外顯子)的序列上，發(fā)現(xiàn)了13個(gè)SNP位點(diǎn)，顛換突變4個(gè)，轉(zhuǎn)換突變9個(gè)。另外，在第4內(nèi)

10、含子上還存在一個(gè)GA→TC的雙突變。(3)TXNIP，3331bp，包含7個(gè)內(nèi)含子和8個(gè)外顯子。在全序列中，發(fā)現(xiàn)了11個(gè)SNP位點(diǎn)，顛換突變3個(gè)，轉(zhuǎn)換突變8個(gè)。(4)PGK1，1105bp，包含部分第9、11外顯子以及完整的第9、10內(nèi)含子和第10外顯子序列，在其上發(fā)現(xiàn)了8個(gè)SNP位點(diǎn)，顛換突變1個(gè)，轉(zhuǎn)換突變7個(gè)。(5)KIAA1717，2032bp，3’UTR，GenBank登錄號(hào)為AY900164，在其上發(fā)現(xiàn)了3個(gè)SNP位點(diǎn)，全為轉(zhuǎn)

11、換突變。所有內(nèi)含子5’端都為GT，3’端都為AG，符合“GT-AG”法則。 8.利用PCR-RFLP技術(shù)，對(duì)其中4個(gè)SNP位點(diǎn)在不同豬群中進(jìn)行了基因分型。并在大白×梅山F2中與性狀進(jìn)行了相關(guān)分析，結(jié)果表明：MS60-2-NcoⅠ-RFLP的不同基因型主要與肌內(nèi)脂肪和肌內(nèi)水分極顯著相關(guān)；MS60-345-1-TspEⅠ-RFLP的不同基因型主要與背膘厚、肌內(nèi)水分顯著相關(guān)；DB245-2-MspⅠ-RFLP的不同基因型主要與眼肌寬、