基于MeDIP-Seq研究皖南花豬和大約克豬背最長肌基因差異甲基化.pdf

1、以脂肪、肌肉為代表的豬肉質(zhì)性狀是養(yǎng)豬業(yè)重要的經(jīng)濟(jì)性狀。不同個(gè)體豬因品種、生存環(huán)境、性別等因素在生長速度、骨骼肌表型等方面差異很大。本研究選取皖南花豬（脂肪型）和大約克豬（瘦肉型）背最長肌，研究DNA甲基化影響不同豬種背最長肌發(fā)育的分子機(jī)制和調(diào)控機(jī)制。目的在于篩選調(diào)控豬肉質(zhì)性狀的關(guān)鍵功能候選基因，為今后豬肉質(zhì)性狀的深入研究提供理論基礎(chǔ)。
　　采用MeDIP-Seq技術(shù)對皖南花豬3頭（WH-1，WH-2和WH-3）、大約克豬3頭(YY

2、-1，YY-2和YY-3)背最長肌進(jìn)行全基因組DNA甲基化測序，對甲基化圖譜進(jìn)行分析認(rèn)證。對差異甲基化基因進(jìn)行GO功能注釋和KEGG Pathway分析，從而篩選出與脂肪酸生成和分解等肉質(zhì)性狀相關(guān)的功能基因和調(diào)控通路，初步闡述DNA甲基化調(diào)控肉質(zhì)性狀形成的分子機(jī)制。并采用焦磷酸測序(Pyrosequencing)方法對高通量測序的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。同時(shí)，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室前期對同一樣品的RNA-Seq的研究結(jié)果進(jìn)行DNA甲基化和表達(dá)譜的聯(lián)合分析，篩

3、選出DNA甲基化差異同時(shí)RNA表達(dá)差異的基因。
　　本研究獲得主要結(jié)果如下:
　　(1)WH-1，WH-2和WH-3樣本分別生成33179625，37610867和32924118個(gè)有效resds，YY-1，YY-2和YY-3，樣本分別生成31，634，309，31，056，478和27，457，277個(gè)有效resds。在去除低質(zhì)量的原始數(shù)據(jù)后，六組數(shù)據(jù)生成平均30.8Gb的clean reads，有效reads率為98.8

4、4％～98.96％。然后將所有的reads映射到參照基因組，根據(jù)Sscrofa10.2共有77.73％～85.65％的有效率。
　　(2)得到皖南花豬、大約克豬peaks數(shù)分別為WH-1，120，443;WH-2，206,080;WH-3，193，398;YY-1，194，507;YY-2，223，008;YY-3，171，769。針對所得到的peaks數(shù)獲得58283個(gè)DMRs，其中12086為超甲基化，46197個(gè)為低甲基化。

5、
　　(3)試驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)甲基化程度低于基因本體、轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)。Peaks甲基化程度由高到低大致為:基因間區(qū)＞內(nèi)含子、CDS區(qū)域＞轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)＞5'非編碼區(qū)、3'非編碼區(qū)。
　　(4)對測序結(jié)果進(jìn)行分析，存在顯著差異甲基化表達(dá)基因共有1425個(gè)，其中上調(diào)基因有447個(gè)，下調(diào)基因有978個(gè)。
　　(5)GO功能富集得到分類條目346個(gè)，其中細(xì)胞組分相關(guān)差異基因占11.56％;分子功能相關(guān)差異基因

6、占15.61％;生物過程相關(guān)差異基因占72.83％。GO分析發(fā)現(xiàn)在皖南花豬和大約克豬肉品質(zhì)性狀形成過程差異基因富集在脂肪酸代謝、脂肪酸生物合成過程、脂質(zhì)代謝過程、脂質(zhì)分解過程等。
　　(6)根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫注釋差異甲基化表達(dá)基因Pathway顯著性富集分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些基因參與了277條生物學(xué)代謝通路，其中有24條存在顯著性富集(P＜0.05)。主要包括脂肪細(xì)胞因子信號通路、PPAR信號通路、MAPK信號通路、甘油酯代謝、胰島素

7、信號通路、蛋白質(zhì)的消化和吸收、cAMP信號通路。
　　(7)結(jié)合MeDIP-seq和之前RNA-seq的試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行DNA甲基化和表達(dá)譜的聯(lián)合分析。結(jié)果表明，80個(gè)基因存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，其中RXRG、GPI、CPT2和GABARAPL1基因顯著負(fù)相關(guān)。
　　(8)從篩選出的與肉質(zhì)性狀有關(guān)的差異基因中隨機(jī)挑選7個(gè)差異甲基化基因，采用Pyrosequencing方法進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證，試驗(yàn)結(jié)果表明，Pyrosequencing方法差異