MeDIP-seq檢測游離SiO2所致肺成纖維細胞轉(zhuǎn)分化的DNA甲基化.pdf

1、目的:
　　塵肺病是我國職業(yè)病中占比例最多的疾病，一直以來影響著發(fā)病者的生活質(zhì)量和社會的經(jīng)濟發(fā)展，而游離 SiO2粉塵致肺纖維化作用最強，矽肺也是塵肺中進展最快、死亡率最高的一種之一。長期以來，人們對矽肺進行了大量研究，但是其發(fā)病機制仍不清楚，因而缺乏有效的早期診斷、動態(tài)觀察的生物標志，也不能消除或逆轉(zhuǎn)肺組織纖維化。隨著表觀遺傳學的研究和發(fā)展，表觀遺傳學調(diào)控可能是矽肺形成中成纖維細胞轉(zhuǎn)分化的重要機制。本課題組前期研究在建立細胞共培

2、養(yǎng)的矽肺體外模型基礎(chǔ)上，通過高效液相色譜法對矽肺中肺成纖維細胞 DNA甲基化進行了研究，發(fā)現(xiàn)整體甲基化程度降低，因此認為DNA甲基化改變可能是矽肺發(fā)生發(fā)展的一種調(diào)控方式。但并未進行甲基化特異性位點的探索和研究，而相關(guān)研究也尚未見報道。因此，該研究采用 DNA甲基化免疫共沉淀測序（MeDIP-seq）技術(shù)對SiO2所致肺成纖維細胞轉(zhuǎn)分化過程中可能存在的DNA甲基化差異基因進行檢測，并探討其可能的機制，為進一步研究其表觀遺傳學調(diào)控機制提供實

3、驗基礎(chǔ)。
　　方法:
　　本次實驗中采取組織塊法提取雄性 SD大鼠的肺成纖維細胞進行原代培養(yǎng)，培養(yǎng)至6-8代時轉(zhuǎn)移至6孔板中。采用肺泡灌洗術(shù)提取雄性SD大鼠的肺泡巨噬細胞。使用 transwell對肺成纖維細胞和肺泡巨噬細胞進行共培養(yǎng)，肺成纖維細胞在下層，巨噬細胞在transwell之上，建立矽肺體外模型。使用100μg/ml的SiO2的工作液對共培養(yǎng)模型的巨噬細胞進行染毒處理，分別在0h（A1）、24h（A2）、48h（A

4、3）收取成纖維細胞。采用QIAamp DNA Mini Kit試劑盒提取成纖維細胞的DNA。采用DNA甲基化免疫共沉淀測序（MeDIP-seq）技術(shù)對不同組的DNA進行DNA甲基化的檢測，測序所得到的數(shù)據(jù)經(jīng)過初步的篩選和處理之后用于后續(xù)的分析。分別對測序所得reads和高甲基化區(qū)域掃描peak進行統(tǒng)計描述和基因元件分布的描述。進一步的對差異甲基化區(qū)域和差異基因進行統(tǒng)計，并使用DAVID工具對DNA甲基化差異基因進行GO和KEGG pat

5、hway的生物信息學分析。使用亞硫酸氫鹽測序的方法對MeDIP-seq的結(jié)果進行驗證。
　　結(jié)果:
　　1. MeDIP-seq數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)分別有26,048,428（60.90％）、34,162,578（61.53%）、33,314,252（60.18%）個Reads比對到了大鼠的參考基因組上，進一步的分析發(fā)現(xiàn)，分別有22,192,364、28,930,222、28,256,146個Reads比對到參考基因組的唯一位置上。

6、基因組功能原件的分布分析發(fā)現(xiàn)，集中在基因間區(qū)的reads最多，其次是內(nèi)含子和外顯子等。
　　2.掃描顯著性的甲基化 peak區(qū)域，分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，總共308,723個peak被掃描發(fā)現(xiàn)，在各組分別有208,253、206,685和232,504個peak掃描獲得，分別有208,253、206,685、232,504個 peak定位在了基因的功能元件上。在不同的功能元件上，在基因間區(qū)的peak數(shù)量最多，內(nèi)含子次之。
　　3. D

7、NA甲基化差異區(qū)域?qū)?yīng)的唯一差異基因有16,292個，其中A1與A2的比較組中有13,311個，A2與A3的比較組中有13,753個，A1與A3的比較組中有13,381個，更深入的分析發(fā)現(xiàn)總共有8,791個基因被發(fā)現(xiàn)在三個差異組中都存在。
　　4. DNA甲基化差異基因的GO分析發(fā)現(xiàn)這些差異基因主要集中在生物學過程、構(gòu)成細胞的組分，實現(xiàn)的分子功能三個大的分類中。其中4,402個基因分類在生物學過程中，3,920個基因分類在細胞組成

8、成份，4,290個基因分類在分子功能中。
　　5. DNA甲基化差異基因的KEGG pathway分析發(fā)現(xiàn)，這些差異甲基化基因主要富集在37個通路中，這37個通路按照其特征又歸化為了5個大類的通路，包括新陳代謝、環(huán)境信息加工、細胞過程、生物體系統(tǒng)和人類疾病相關(guān)的通路。
　　結(jié)論:
　　成纖維細胞轉(zhuǎn)分化過程中涉及的DNA甲基化改變的位點主要分布在基因的基因間區(qū)和內(nèi)含子、外顯子區(qū)域，啟動子和基因下游區(qū)域很少。
　　成

9、纖維細胞轉(zhuǎn)分化過程中存在大量DNA甲基化程度發(fā)生改變的基因，這些基因的功能主要集中在與磷代謝相關(guān)的生物學過程、質(zhì)膜相關(guān)的細胞組成成份和離子通道相關(guān)的分子功能中。
　　成纖維細胞轉(zhuǎn)分化過程可能與線粒體的能量活動有關(guān)；成纖維細胞轉(zhuǎn)分化后形成肺纖維化的主要形式是成纖維細胞與細胞外基質(zhì)的連接形成粘著斑；成纖維細胞轉(zhuǎn)分化過程中有與突觸形成相關(guān)基因的功能變化變化；成纖維細胞轉(zhuǎn)分化過程與癌癥形成有許多相似的過程，其中的MAPK、Wnt、ErbB