胸腺細(xì)胞分化抗原-1DNA甲基化在硫酸鈹致人胚肺成纖維細(xì)胞纖維化中的作用研究.pdf

1、目的：觀察硫酸鈹（BeSO4）刺激下人胚肺成纖維細(xì)胞（MRC-5）中胸腺細(xì)胞分化抗原-1（Thy-1）DNA甲基化改變情況，Thy-1mRNA及蛋白的變化，纖維化相關(guān)因子膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅲ、α-SMA mRNA及蛋白的改變，探討Thy-1DNA甲基化在BeSO4致肺纖維化中的作用。用甲基化轉(zhuǎn)移酶酶抑制劑5-氮雜胞苷（AZC）干預(yù)MRC-5進(jìn)一步驗(yàn)證Thy-1DNA甲基化變化。使用組蛋白乙?；敢种苿┣乓志谹（TSA），觀察MRC

2、-5中是否同時(shí)存在組蛋白乙?；Ｍ瑫r(shí)觀察在這兩種抑制劑的作用下，纖維相關(guān)因子和Thy-1的表達(dá)情況。
　　方法：建立離體MRC-5培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，以終濃度分別為1.0、10.0、100.0μmol/L的BeSO4染毒（設(shè)為低、中、高劑量組），對(duì)照組不作染毒處理；另設(shè)AZC干預(yù)組，終濃度為10.0μmol/L的硫酸鈹和10.0μmol/L AZC混合液處理組（BeSO4+AZC組）和TSA干預(yù)組，終濃度為10.0μmol/L的硫酸鈹和

3、0.5μmol/L TSA混合液處理組（BeSO4+TSA組）。分別在染毒24、48和72h后收集細(xì)胞，采用實(shí)時(shí)定量式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅲ和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）和Thy-1mRNA相對(duì)表達(dá)水平；巢式降落式甲基化特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)Thy-1DNA甲基化水平；蛋白免疫印跡法（western-blot）檢測(cè)膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅲ、α-SMA和Thy-1蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。
　　結(jié)果：1.MRC-5細(xì)

4、胞中膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅲ和α-SMA的mRNA的蛋白相對(duì)表達(dá)水平均呈隨染毒劑量增加而增加的趨勢(shì)（P＜0.05或P＜0.01））；低、中、高劑量組膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅲ和α-SMA的mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)水平均呈隨著染毒時(shí)間的增加而升高的趨勢(shì)（P＜0.05或P＜0.01））；AZC和TSA干預(yù)后，24、48、72h時(shí)間點(diǎn)，BeSO4+AZC組、BeSO4+TSA組3個(gè)指標(biāo)的蛋白相對(duì)表達(dá)水平均低于中劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）

5、；
　　2.24、48、72h時(shí)間點(diǎn)上，中、高劑量組Thy-1DNA甲基化水平均高于對(duì)照組（P＜0.05或P＜0.01）；低、中、高劑量組Thy-1DNA甲基化水平呈隨染毒劑量增加而增加趨勢(shì)（P＜0.05）；AZC和TSA干預(yù)后，48、72h時(shí)間點(diǎn)上，BeSO4+AZC組、BeSO4+TSA組Thy-1DNA甲基化水平均低于中、高劑量（P＜0.05）；
　　3.24、48、72h時(shí)間點(diǎn)上，低、中、高劑量組MRC-5細(xì)胞Thy

6、-1mRNA和蛋白的相對(duì)表達(dá)水平均低于對(duì)照組（P＜0.01或P＜0.01）；AZC和TSA干預(yù)后，48、72h時(shí)間點(diǎn)上，BeSO4+AZC組、BeSO4+TSA組Thy-1蛋白的相對(duì)表達(dá)水平均高于中劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。
　　結(jié)論：在硫酸鈹刺激下可導(dǎo)致MRC-5細(xì)胞纖維化的發(fā)生，該過(guò)程中Thy-1DNA甲基化程度升高，Thy-1mRNA表達(dá)水平降低，可能是硫酸鈹致肺纖維化的重要機(jī)制之一，在該過(guò)程中可能同時(shí)存在組