JNK信號通路在二甲基胂酸所致人胚肺成纖維細胞DNA損傷和凋亡中的作用.pdf

1、砷是人類確定(Ⅰ類)致癌物，通過食用含有無機砷化物的水和食物所引起的砷中毒在全世界廣泛存在。另外一方面，砷還是多種腫瘤有效化學治療藥物，因此，環(huán)境和醫(yī)源性接觸砷化物的機會大大增加。二甲基胂酸(DMA)是無機砷在人體內(nèi)的主要的甲基化代謝產(chǎn)物，其本身也廣泛用作殺蟲劑。傳統(tǒng)的觀念一直認為砷在體內(nèi)的甲基化過程是一個解毒促排泄過程，但是最近有研究表明DMA可引起細胞DNA斷裂，DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)和細胞凋亡，認為DMA具有遺傳毒性和致癌性。最近越來

2、越多的研究表明砷的甲基化過程可能不僅僅是個解毒機制，砷在體內(nèi)的甲基化過程可能在砷致癌過程中發(fā)揮重要作用。目前關(guān)于砷甲基化代謝產(chǎn)物在體外毒性機制的研究較少，DMA損傷細胞的機制還不太清楚，其中關(guān)于信號通路在其中的作用的研究比較少。c-Jtm氨基末端激酶(JNK)信號通路是絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)家族信號通路的重要亞通路之一，其參與調(diào)控細胞增殖、分化與凋亡。有研究發(fā)現(xiàn)JNK信號通路在無機砷及其化合物所致細胞損傷中發(fā)揮一定作用。因此，闡

3、明DMA淞所致細胞損傷及其分子機制對于探討砷致癌分子機制及砷中毒的防治具有重要意義。 本課題擬探討不同濃度DMA對人胚肺成纖維細胞(HELF)增殖、DNA損傷、細胞周期和凋亡及JNK信號通路的影響；并應(yīng)用JNK抑制劑和反義抑制技術(shù)構(gòu)建JNK缺陷HELF胞，以阻斷JNK信號通路來深入探討JNK信號通路在DMA所致HELF細胞DNA損傷和凋亡中的作用，為進一步揭示DMA所致細胞損傷的分子機制，全面了解砷的致癌分子機制和砷化物對機體的

4、影響提供一定的科學依據(jù)。 方法 一、DMA對HELF細胞增殖的影響用0.0、2.5、5.0、10.0、20.0μmol/L DMA分別處理HELF細胞12、24、48h，用MTT法和CCK-8法檢測HELF細胞相對增殖率，尋找其所致HELF細胞增殖的劑量-效應(yīng)和時間-效應(yīng)關(guān)系。 二、DMA對HELF細胞DNA損傷的影響用0.0、2.5、5.0、10.0、20.0μmol/L DMA分別處理HELF細胞12、24、

5、48h，收集HELF細胞蛋白，用Western blot檢測HELF細胞γ-H2AX蛋白表達水平，并用同一張膜上相應(yīng)泳道的β-actin條帶的灰度進行校正。 三、DMA對HELF細胞周期的影響用0.0、2.5、5.0、10.0、20.0μmol/L DMA分別處理HELF細胞48h或用20.0μmol/L DMA分別處理HELF細胞12、24、48h，收集細胞，用流式細胞儀檢測細胞周期的變化。 四、DMA對HELF細胞凋

6、亡的影響用0.0、2.5、5.0、10.0、20.0μmol/L DMA分別處理HELF細胞12、24、48h，分別用Hoechst 33258法檢測HELF細胞凋亡形態(tài)學變化及細胞凋亡率和用Western blot檢測HELF細胞斷裂Caspase 3蛋白表達水平，尋找其劑量-效應(yīng)和時間-效應(yīng)關(guān)系。 五、DMA對HELF細胞磷酸化JNK表達水平的影響用0.0、2.5、5.0、10.0、20.0μmol/L DMA分別處理HEL

7、F細胞12、24、48h，收集HELF細胞蛋白，用Western blot檢測HELF細胞JNK、和磷酸化JNK蛋白表達水平，并用同一張膜上相應(yīng)泳道的β-actin條帶的灰度進行校正。 六、JNK缺陷HELF細胞株建立從HELF細胞中抽提總RNA，用RT-PCR法擴增目的DNA片段，經(jīng)重組技術(shù)構(gòu)建JNK基因反義RNA綠色熒光真核表達質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HELF細胞，經(jīng)G418篩選后，用Western blot檢測JNK蛋白含量，

8、確認獲得JNK缺陷HELF細胞株。 七、抑制JNK對DMA所致細胞DNA損傷與凋亡的影響預先用20.0μmol/L JNK抑制劑SP600125處理HELF細胞30min，然后用20.0μmol/L DMA處理HELF細胞48h，再分別檢測HELF細胞DNA損傷和細胞凋亡情況。用20.0μmol/L DMA處理JNK缺陷HELF細胞(asJNK-HELF)和空載HELF細胞(C1-HELF)48h，再分別檢測這兩種細胞DNA損傷