人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為汗腺樣細(xì)胞的DNA甲基化調(diào)控機(jī)制.pdf

1、目的:
　　(1)優(yōu)化人外分泌汗腺細(xì)胞（sweat gland cells，SGCs）的分離方法，以高效地獲取原代汗腺細(xì)胞。
　　(2)建立體外誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BM-MSCs）向汗腺樣細(xì)胞分化的共培養(yǎng)體系，并觀察誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)、表型和相關(guān)基因表達(dá)的改變。
　　(3)探討DNA甲基化在BM-MSCs向汗腺樣細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過(guò)程中的調(diào)控作用，并尋找甲基化調(diào)控的靶點(diǎn)基因。
　　方法：
　?。?）取新鮮的全皮層組

2、織，剪成小塊微粒，分別用不同的方法（胰酶+膠原酶，單純胰酶，單純膠原酶）消化分離汗腺，觀察消化過(guò)程中出現(xiàn)游離汗腺的時(shí)間；微量移液器挑取游離汗腺，進(jìn)行體外培養(yǎng)，觀察細(xì)胞的貼壁情況和生長(zhǎng)狀態(tài)；9天后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)存活下來(lái)的細(xì)胞的增殖能力，并利用免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)汗腺細(xì)胞的表面抗原CK7和CEA的表達(dá)狀況。
　?。?）購(gòu)買(mǎi)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞系，體外培養(yǎng)、擴(kuò)增，并進(jìn)行細(xì)胞的成脂肪、成骨細(xì)胞分化能力的鑒定；選取第三代的BM-MSCs與熱休克后

3、汗腺細(xì)胞（47℃）進(jìn)行 Transwell+誘導(dǎo)因子的共培養(yǎng)，分別于第3、6、9天觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化，設(shè)置汗腺細(xì)胞為陽(yáng)性對(duì)照組。細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞汗腺表面抗原CK7和CEA的表達(dá)，RT-PCR和Western blot分別檢測(cè)CK7、CEA在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)變化。
　　（3）采用Illumina450K甲基化芯片檢測(cè)轉(zhuǎn)分化前后細(xì)胞的甲基化水平的變化，篩選甲基化差異性基因，隨后對(duì)差異基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析（差異位

4、點(diǎn)篩選、聚類(lèi)層次分析、Gene Ontology、KEGGPathway分析、生物學(xué)功能注釋、蛋白-蛋白相互作用）；結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)若干候選基因(HDAC4、PAX6、MMP1、EDA等)，用甲基化特異性PCR(Methylation Specific PCR，MSP)進(jìn)行初步驗(yàn)證，然后通過(guò)Mass Array飛行質(zhì)譜技術(shù)對(duì)特定基因位點(diǎn)進(jìn)行重點(diǎn)分析；最后，構(gòu)建特定基因的重組質(zhì)粒，體外轉(zhuǎn)染 BM-MSCs，觀察質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后細(xì)胞表

5、型和相關(guān)基因的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　?。?）酶聯(lián)合消化法(A組)在2h時(shí)，鏡下可見(jiàn)較多游離的汗腺細(xì)胞；胰蛋白酶-EDTA法（C組）獲取的細(xì)胞貼壁很差；膠原酶法（B組）在6h左右時(shí)，才有較多的游離汗腺出現(xiàn)。A組和B組獲取后的汗腺細(xì)胞貼壁良好，生長(zhǎng)增殖正常,流式檢測(cè)結(jié)果顯示：A組和B組細(xì)胞的增殖指數(shù)分別為(18±4)％和(17±6)%，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。免疫細(xì)胞化學(xué)表型鑒定結(jié)果顯示：酶聯(lián)合消化組和膠原酶組獲取的細(xì)胞CEA、CK7

6、陽(yáng)性率未見(jiàn)明顯差異。
　?。?）通過(guò)多向分化潛能實(shí)驗(yàn)，我們證實(shí) BM-MSCs可以分化為脂肪細(xì)胞和骨細(xì)胞。Transwell+誘導(dǎo)因子共培養(yǎng)3天時(shí)，BM-MSCs的細(xì)胞形態(tài)基本沒(méi)有變化，仍呈長(zhǎng)梭形；共培養(yǎng)9d后，細(xì)胞形態(tài)呈多樣化，部分細(xì)胞出現(xiàn)近似于汗腺樣細(xì)胞的改變，由誘導(dǎo)前的長(zhǎng)梭形變?yōu)楸馄讲灰?guī)則狀，并且逐步聚集呈向心性生長(zhǎng)。對(duì)汗腺樣細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光、RT-PCR和Western blot檢測(cè)，都發(fā)現(xiàn)其不同程度地表達(dá)汗腺細(xì)胞表面

7、抗原CK7、CEA。
　?。?）采用 Illumina甲基化芯片，在全基因組范圍內(nèi)初步篩選出甲基化水平明顯差異的探針位點(diǎn)693個(gè)；甲基化差異性基因有437個(gè)基因（升高97個(gè)，下降350個(gè)）；差異位點(diǎn)區(qū)域分布顯示：主要分布在N_Shore和CpG islands區(qū)域，基因區(qū)域分布主要集中在Genebody和TSS200區(qū)域。Gene Ontology和KEGG pathway分析顯示：主要涉及細(xì)胞命運(yùn)界定、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與基因表達(dá)、轉(zhuǎn)錄阻

8、遏、外胚層發(fā)育等生物學(xué)過(guò)程。MSP和Mass Array飛行質(zhì)譜結(jié)果顯示：與誘導(dǎo)前BM-MSC相比，誘導(dǎo)后汗腺樣細(xì)胞中HDAC4的甲基化水平明顯下調(diào)，與甲基化芯片結(jié)果大體一致。轉(zhuǎn)染 HDAC4質(zhì)粒載體后，免疫細(xì)胞化學(xué)和 RT-PCR結(jié)果都顯示CEA表達(dá)明顯上調(diào)。
　　結(jié)論：
　?。?）胰蛋白酶和膠原酶聯(lián)合應(yīng)用能明顯縮短汗腺細(xì)胞的分離時(shí)間，且不影響細(xì)胞的增殖活性和抗原表達(dá)情況。
　?。?） BM-MSCs和熱休克汗腺間接