豬NCOA3啟動(dòng)子甲基化對(duì)其在肌內(nèi)脂肪與皮下脂肪組織差異表達(dá)的影響.pdf

1、肌內(nèi)脂肪沉積的調(diào)控對(duì)提高動(dòng)物生產(chǎn)效率具有重要的意義。肌內(nèi)脂肪的沉積影響著肉質(zhì)品質(zhì)，了解脂肪在肌內(nèi)脂肪與皮下脂肪差異沉積的機(jī)制，通過提高肌內(nèi)脂肪沉積的同時(shí)，不影響甚至減少皮下脂肪沉積，對(duì)于提高豬肉品質(zhì)，降低經(jīng)濟(jì)浪費(fèi)至關(guān)重要。核受體輔激活蛋白3(Nuclear receptor coactivator3，NCOA3)是固醇類輔激活蛋白家族的一員，有實(shí)驗(yàn)證明，NCOA3通過與C/EBPδ和C/EBPα相互作用調(diào)控PPARγ2轉(zhuǎn)錄活性，在脂肪分

2、化和代謝中發(fā)揮重要作用。為了研究皮下與肌內(nèi)脂肪組織的差異沉積機(jī)制，我們通過生物信息學(xué)分析，了解NCOA3的蛋白結(jié)構(gòu)，通過構(gòu)建啟動(dòng)子缺失報(bào)告載體，分析NCOA3的啟動(dòng)子活性。同時(shí)比較皮下脂肪組織與肌內(nèi)脂肪組織中NCOA3的表達(dá)水平，并從甲基化表觀調(diào)控水平上尋找NCOA3在兩種組織中的表達(dá)差異機(jī)制，為特異性調(diào)控肌內(nèi)脂肪的沉積提供理論依據(jù)。結(jié)果如下:
　　1、豬NCOA3基因的生物信息學(xué)分析
　　NCOA3基因mRNA含有4173

3、bp的開放閱讀框，編碼1390個(gè)氨基酸，蛋白分子量為151.2kDa。不存在信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)，具有極強(qiáng)的親水性及復(fù)雜的螺旋結(jié)構(gòu)，但穩(wěn)定性不好，這可能與其結(jié)構(gòu)、功能的復(fù)雜性有關(guān)。通過比較人、鼠以及豬的NCOA3氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)三者具有極高的相似性(88.16％)，因此可以基于NCOA3在人與鼠上的研究推測(cè)其對(duì)豬中脂肪分化的影響。
　　2、豬NCOA3基因5'側(cè)翼序列缺失報(bào)告載體的構(gòu)建與啟動(dòng)子活性分析
　　構(gòu)建了豬的六個(gè)雙熒光素

4、酶報(bào)告基因表達(dá)載體，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到PK15細(xì)胞和豬的肝細(xì)胞中檢測(cè)熒光活性。結(jié)果表明，豬NCOA3基因的核心啟動(dòng)子位于上游-150～-3bp之間，通過預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)豬的NCOA3基因啟動(dòng)子區(qū)只存在一個(gè)CpG島，且位于上游-930～-699bp。對(duì)其啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)在CpG島內(nèi)含有SP1、c-Jun、CREBP1、CEBPδ等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，其中SP1為甲基化敏感位點(diǎn)。推測(cè)CpG島可能影響NCOA3的啟動(dòng)子活性。
　　3、豬NC

5、OA3基因CpG島甲基化水平與其表達(dá)水平
　　利用實(shí)時(shí)定量PCR(RT-qPCR)比較皮下脂肪與肌內(nèi)脂肪組織中NCOA3mRNA的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)NCOA3基因在肌內(nèi)脂肪組織中的表達(dá)量顯著低于其在皮下脂肪組織的表達(dá)，兩者差異極顯著(P＜0.01)。同時(shí)采用亞硫酸鹽測(cè)序(BSP)方法檢測(cè)NCOA3基因CpG島的甲基化水平，發(fā)現(xiàn)該CpG島總體甲基化水平在皮下與肌內(nèi)脂肪組織中分別為83.5％和90％，但是差異不顯著（P=0.11）。對(duì)Cp

6、G島進(jìn)行單位點(diǎn)分析，結(jié)果表明-904位點(diǎn)甲基化程度在皮下與肌內(nèi)脂肪組織間差異顯著(P＜0.05)，其中皮下脂肪的甲基化比例為20％，肌內(nèi)脂肪甲基化比例為55％。為檢測(cè)甲基化是否影響NCOA3基因的啟動(dòng)子活性，我們對(duì)NCOA3啟動(dòng)子進(jìn)行體外甲基化處理，發(fā)現(xiàn)甲基化轉(zhuǎn)移酶處理后啟動(dòng)子活性顯著下降（P＜0.05）。同時(shí)轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)-904位點(diǎn)附近（-903～-894bp）有一C/EBPδ結(jié)合位點(diǎn)，我們將該轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染測(cè)