豬NCOA3啟動子甲基化對其在肌內(nèi)脂肪與皮下脂肪組織差異表達的影響.pdf

1、肌內(nèi)脂肪沉積的調(diào)控對提高動物生產(chǎn)效率具有重要的意義。肌內(nèi)脂肪的沉積影響著肉質(zhì)品質(zhì)，了解脂肪在肌內(nèi)脂肪與皮下脂肪差異沉積的機制，通過提高肌內(nèi)脂肪沉積的同時，不影響甚至減少皮下脂肪沉積，對于提高豬肉品質(zhì)，降低經(jīng)濟浪費至關(guān)重要。核受體輔激活蛋白3(Nuclear receptor coactivator3，NCOA3)是固醇類輔激活蛋白家族的一員，有實驗證明，NCOA3通過與C/EBPδ和C/EBPα相互作用調(diào)控PPARγ2轉(zhuǎn)錄活性，在脂肪分

2、化和代謝中發(fā)揮重要作用。為了研究皮下與肌內(nèi)脂肪組織的差異沉積機制，我們通過生物信息學(xué)分析，了解NCOA3的蛋白結(jié)構(gòu)，通過構(gòu)建啟動子缺失報告載體，分析NCOA3的啟動子活性。同時比較皮下脂肪組織與肌內(nèi)脂肪組織中NCOA3的表達水平，并從甲基化表觀調(diào)控水平上尋找NCOA3在兩種組織中的表達差異機制，為特異性調(diào)控肌內(nèi)脂肪的沉積提供理論依據(jù)。結(jié)果如下:
　　1、豬NCOA3基因的生物信息學(xué)分析
　　NCOA3基因mRNA含有4173

3、bp的開放閱讀框，編碼1390個氨基酸，蛋白分子量為151.2kDa。不存在信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)，具有極強的親水性及復(fù)雜的螺旋結(jié)構(gòu)，但穩(wěn)定性不好，這可能與其結(jié)構(gòu)、功能的復(fù)雜性有關(guān)。通過比較人、鼠以及豬的NCOA3氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)三者具有極高的相似性(88.16％)，因此可以基于NCOA3在人與鼠上的研究推測其對豬中脂肪分化的影響。
　　2、豬NCOA3基因5'側(cè)翼序列缺失報告載體的構(gòu)建與啟動子活性分析
　　構(gòu)建了豬的六個雙熒光素

4、酶報告基因表達載體，瞬時轉(zhuǎn)染到PK15細(xì)胞和豬的肝細(xì)胞中檢測熒光活性。結(jié)果表明，豬NCOA3基因的核心啟動子位于上游-150～-3bp之間，通過預(yù)測發(fā)現(xiàn)豬的NCOA3基因啟動子區(qū)只存在一個CpG島，且位于上游-930～-699bp。對其啟動子區(qū)進行轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測，發(fā)現(xiàn)在CpG島內(nèi)含有SP1、c-Jun、CREBP1、CEBPδ等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，其中SP1為甲基化敏感位點。推測CpG島可能影響NCOA3的啟動子活性。
　　3、豬NC

5、OA3基因CpG島甲基化水平與其表達水平
　　利用實時定量PCR(RT-qPCR)比較皮下脂肪與肌內(nèi)脂肪組織中NCOA3mRNA的表達水平，發(fā)現(xiàn)NCOA3基因在肌內(nèi)脂肪組織中的表達量顯著低于其在皮下脂肪組織的表達，兩者差異極顯著(P＜0.01)。同時采用亞硫酸鹽測序(BSP)方法檢測NCOA3基因CpG島的甲基化水平，發(fā)現(xiàn)該CpG島總體甲基化水平在皮下與肌內(nèi)脂肪組織中分別為83.5％和90％，但是差異不顯著（P=0.11）。對Cp

6、G島進行單位點分析，結(jié)果表明-904位點甲基化程度在皮下與肌內(nèi)脂肪組織間差異顯著(P＜0.05)，其中皮下脂肪的甲基化比例為20％，肌內(nèi)脂肪甲基化比例為55％。為檢測甲基化是否影響NCOA3基因的啟動子活性，我們對NCOA3啟動子進行體外甲基化處理，發(fā)現(xiàn)甲基化轉(zhuǎn)移酶處理后啟動子活性顯著下降（P＜0.05）。同時轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測發(fā)現(xiàn)-904位點附近（-903～-894bp）有一C/EBPδ結(jié)合位點，我們將該轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點進行突變，瞬時轉(zhuǎn)染測