豬皮下脂肪組織發(fā)育過(guò)程mRNA轉(zhuǎn)錄組鑒定和差異分析.pdf

1、脂肪組織不僅是機(jī)體重要的能量代謝器官，還作為重要的內(nèi)分泌器官分泌一些脂肪因子如脂聯(lián)素、瘦素、抵抗素等，對(duì)肥胖、糖尿病以及心血管等代謝疾病都有重要的作用。近年來(lái)，豬作為研究人類(lèi)能量代謝和肥胖的模型越來(lái)越受到關(guān)注，因?yàn)閮烧咴诮Y(jié)構(gòu)和功能上存在許多相似性，比如身體大小、消化道系統(tǒng)、解剖學(xué)、代謝、脂肪分布、飲食習(xí)慣和病理學(xué)特征。同時(shí)，了解豬脂肪組織生長(zhǎng)與發(fā)育的機(jī)制有助于改善豬肉生產(chǎn)效率。目前對(duì)于脂肪組織的研究較多集中在人類(lèi)身上，這是由于肥胖已經(jīng)成

2、為影響人類(lèi)健康的重大疾病之一，但對(duì)豬脂肪組織的研究還比較有限，因此可以借鑒在人類(lèi)身上的研究，做到兩者之間相輔相成。脂肪組織可以分為皮下脂肪和內(nèi)臟脂肪兩大類(lèi)，它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)和功能上呈現(xiàn)出顯著的差異，皮下脂肪組織主要作為能量?jī)?chǔ)存組織在體內(nèi)調(diào)節(jié)能量平衡，而內(nèi)臟脂肪組織的解剖學(xué)位置、靜脈回流模式及其本質(zhì)的和特有的功能都易于發(fā)生脂質(zhì)代謝異常，從而導(dǎo)致心血管疾病和代謝疾病的發(fā)生。另外，皮下脂肪占總體脂的60％～70％，因此減肥都是基于皮下脂肪減少的基礎(chǔ)

3、之上。本研究以豬四個(gè)不同發(fā)育階段背部皮下脂肪組織為研究對(duì)象，通過(guò)石蠟切片分析了脂肪組織細(xì)胞體積的差異;通過(guò)液相色譜測(cè)定了脂肪細(xì)胞因子的含量，探究脂肪組織生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程中脂肪細(xì)胞因子的差異;利用數(shù)字基因表達(dá)譜(DGE)方法，鑒定出了新的mRNA轉(zhuǎn)錄本和高表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本;通過(guò)差異分析篩出在不同發(fā)育階段脂肪組織中差異表達(dá)的基因，分析了線粒體基因在脂肪組織生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程中的作用;對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和脂肪表型指標(biāo)做了關(guān)聯(lián)分析，揭示了引起脂肪組織生長(zhǎng)和發(fā)育

4、的生物學(xué)過(guò)程。
　　利用石蠟切片對(duì)四個(gè)發(fā)育階段的背部皮下脂肪組織細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，豬在出生后(Birth)到7年(7y)，脂肪細(xì)胞體積呈現(xiàn)持續(xù)極顯著增長(zhǎng)模式(P＜0.01);脂肪細(xì)胞體積在豬剛出生時(shí)非常小，在出生后到30天(30 d)增長(zhǎng)極顯著(P＜0.01);從30天到180天(180 d)、180天到7年的過(guò)程中，相互之間也呈現(xiàn)極顯著的增長(zhǎng)（P＜0.01）。
　　對(duì)豬四個(gè)發(fā)育階段脂肪相關(guān)的代謝因子的測(cè)定結(jié)果顯示

5、，豬在出生后到7年的發(fā)育過(guò)程中，與脂肪相關(guān)的代謝因子的水平呈現(xiàn)顯著的下降(P＜0.05)，并且脂肪代謝因子相互之間還存在顯著的相關(guān)性（r＞0.6，P＜0.05）。
　　通過(guò)DGE對(duì)12個(gè)背部皮下脂肪組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，每個(gè)文庫(kù)分別獲得3.66～6.5 M(million)的原始數(shù)據(jù)，大約3.32～6.06 M clean tags和141，865～270，124種clean tags;通過(guò)比對(duì)，12，618個(gè)基因被鑒定出來(lái)用于后續(xù)

6、分析;對(duì)在四個(gè)發(fā)育階段文庫(kù)中表達(dá)量最高的10個(gè)基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)7個(gè)基因（TUBA1B、ND2、COX2、ATP8、COX3、ND1、SCD）在四個(gè)發(fā)育階段中共同高表達(dá)，只是排序發(fā)生了變化。
　　為了評(píng)估實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和操作穩(wěn)定性，對(duì)平行實(shí)驗(yàn)的結(jié)果做了相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，生物學(xué)重復(fù)之間相關(guān)系數(shù)r＞0.95(P＜0.05)，表明本研究所用生物學(xué)個(gè)體具有非常強(qiáng)的重復(fù)性，不同生物學(xué)個(gè)體之間mRNA表達(dá)譜的變異非常低，實(shí)驗(yàn)操作穩(wěn)定性強(qiáng)

7、，結(jié)果可靠，后續(xù)的分析結(jié)果是可信、可靠的。
　　差異基因分析篩選出脂肪組織Birth與30d共有807個(gè)基因差異表達(dá)，;Birth與180 d共有差異基因649個(gè);Birth與7y有1，263個(gè)基因差異表達(dá);30d與180 d有708個(gè)基因差異表達(dá);30d與7y有266個(gè)基因差異表達(dá);180 d與7y有767個(gè)基因差異表達(dá)。通過(guò)GO和Pathway分析，將這些差異基因富集到氧化應(yīng)激、免疫過(guò)程、細(xì)胞凋亡、能量代謝、胰島素刺激、細(xì)胞循

8、環(huán)、血管生成和基因翻譯等生物學(xué)過(guò)程和通路。分析差異基因的分布，結(jié)果發(fā)現(xiàn)線粒體DNA編碼的13個(gè)基因中，其中有9個(gè)為差異表達(dá)的基因;QTL分析顯示有298(9.11％)個(gè)差異基因分布在影響脂肪和肉質(zhì)的QTL區(qū)域。
　　對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行短時(shí)間序列(STEM)分析，其中有5種表達(dá)類(lèi)型的差異基因顯著富集的類(lèi)型;進(jìn)而對(duì)脂肪代謝因子和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)做了關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果顯示顯著富集的差異基因與脂肪代謝因子的水平顯著相關(guān)，其中上調(diào)基因富集于能量代謝和血

9、管生成等生物學(xué)過(guò)程;下調(diào)基因富集于細(xì)胞循環(huán)、類(lèi)固醇、膽固醇、核糖體生物合成和代謝過(guò)程等生物學(xué)過(guò)程。
　　對(duì)差異基因是否是已知衰老基因的分析顯示，HAGE數(shù)據(jù)庫(kù)中有288個(gè)與人類(lèi)衰老潛在相關(guān)的基因，其中61個(gè)基因?yàn)楸狙芯胯b定出的差異基因，達(dá)到顯著富集的水平（P=3.17×10-6）;功能富集分析發(fā)現(xiàn)這61個(gè)基因與DNA修復(fù)、細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)錄和免疫等過(guò)程相關(guān)。
　　通過(guò)Q-PCR驗(yàn)證DGE結(jié)果，兩者之間有很好的相關(guān)性(r＞0.7，