大花蕙蘭授粉前后基因差異分析及DNA甲基化變化的研究.pdf

1、摘要摘要蘭花是開花植物中最大的家族之一，是整個蘭科植物(orchidaceac)的總稱，我國約有173屬，1240余種。其中，大花蕙蘭(Cymbidiumhybridium)，具有重要經(jīng)濟(jì)價值和觀賞價值。蘭科植物發(fā)育的一個獨(dú)特特點(diǎn)是子房發(fā)育時間較長，且只有在授粉后才啟動發(fā)育，形成的種子非常細(xì)小，發(fā)育不完全，幾乎無胚乳，在自然狀態(tài)下很難萌發(fā)，這使得蘭花的有性繁殖困難、以至于整個蘭科植物發(fā)育相關(guān)基礎(chǔ)研究匾乏。本研究選取蘭科植物中具有重要經(jīng)濟(jì)

2、價值和觀賞價值的大花蕙蘭為研究材料，以大花蕙蘭子房獨(dú)特的發(fā)育模式為研究對象，從遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)不同角度，利用基因的差異顯示技術(shù)、同源序列克隆技術(shù)及甲基化敏感限制內(nèi)切酶擴(kuò)增多態(tài)性分析技術(shù)等，探究大花蕙蘭子房啟動發(fā)育的分子機(jī)制，力圖獲得啟動子房發(fā)育的關(guān)鍵基因及表觀遺傳調(diào)控模式，為揭示蘭花子房發(fā)育的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ).此外，還對蘭科植物原球莖從形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)及分子生物學(xué)方面進(jìn)行了初步研究，旨在揭示蘭花原球莖誘導(dǎo)、增殖、分化的內(nèi)在機(jī)制。重點(diǎn)開展

3、的研究如下:1、應(yīng)用mRNA差異顯示技術(shù)比較、分析了大花蕙蘭授粉后兩天與未授粉子房的基因差異表達(dá)情況，共獲得1024條帶。其中60條帶表現(xiàn)為在授粉后子房中特異表達(dá)，經(jīng)進(jìn)一步的反Northern雜交驗證，最終確定在授粉后子房內(nèi)特異表達(dá)的7個cDNA片段。測序后分別命名為CDD313.CDD272.CDD265CDD243CDD193CDD218CDD470(GenBank登錄號:DQ159862DQ159868)。同源性比對發(fā)現(xiàn)，CDD3

4、13CDD272CDD265和CDD243沒有同源序列與之匹配，可能代表了與大花蕙蘭子房發(fā)育相關(guān)的新基因而CDD193CDD218和CDD470的分析結(jié)果表明，三個序列分別與ABC型transporterGTPase和40S核搪體蛋白質(zhì)S3(RPS3)高度同源.2、通過對差異片段CDD470進(jìn)一步的深入分析，獲得了CDD470的全長cDNA序列，命名為ChRPS3(GenBank登錄號:EF065683)，該序列全長1003by，包含一

5、個786by的完整開放讀碼框，可編碼261個氨基酸。同源性比較和系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，ChRPS3在大花蕙蘭中為首次報道，其編碼的蛋白質(zhì)與植物RpS3蛋白具高度相似性。進(jìn)一步采用RTPCR技術(shù)對不同大花蕙蘭單株、根、摘要行選擇性擴(kuò)增，共得到6668條帶，其中甲基化多態(tài)性帶有970條帶，占總甲基化帶數(shù)94.3%數(shù)據(jù)分析表明，總擴(kuò)增位點(diǎn)的甲基化水平分別為增殖原球莖26.7%自分化原球莖24.1%和誘導(dǎo)分化原球莖24.6%，而全甲基化率依次分別為

6、12.2%11.1%和11.4%，這三種原球莖甲基化的水平明顯高于授粉后子房。而且，比較分析三種不同狀態(tài)原球莖DNA的甲基化模式，發(fā)現(xiàn)處于三種不同狀態(tài)的原球莖可產(chǎn)生62種不同的DNA甲基化模式。分化原球莖相對于增殖原球莖發(fā)生了不同程度的去甲基化，但自分化原球莖和誘導(dǎo)分化原球莖DNA甲基化發(fā)生的水平未發(fā)生明顯改變而多態(tài)性模式差異顯著，暗示DNA甲基化水平和模式進(jìn)行了重新調(diào)整，DNA甲基化修飾可能是有選擇性、傾向性的在細(xì)胞分化方面起到非常重