豬骨骼肌肌鈣蛋白I基因的表達(dá)及其單克隆抗體的制備.pdf

1、肉種類摻假不僅違反了食品標(biāo)識(shí)法、公平交易法和消費(fèi)者保護(hù)法，還有宗教因素（回教和印度教），而且肉產(chǎn)品中含有未知種類還可能產(chǎn)生食物過敏和中毒，對(duì)消費(fèi)者有著潛在的危害。目前在肉制品零售市場(chǎng)上，肉種類摻假是一個(gè)普遍存在的現(xiàn)象，尤其是熟肉制品的摻假發(fā)生率更高。由于價(jià)值低，顏色和組織相似，豬肉是價(jià)格較高的牛肉的潛在的摻假資源。
　　 目前生肉鑒別方法已經(jīng)比較成熟，而熟肉制品的鑒別方法比較復(fù)雜，蛋白質(zhì)在加熱期間會(huì)有所變化，如蛋白質(zhì)變性、蛋白質(zhì)

2、的溶解度降低以及喪失抗原性，所以鑒別加工處理過的肉品種類是比較困難的。因此免疫分析法鑒定加熱過的肉品種類或檢測(cè)其摻假情況，必須以具有種屬專一性的耐熱性抗原或熱穩(wěn)定性肌肉蛋白質(zhì)（thermostable muscle proteins，TSMPs）作為指標(biāo)。據(jù)國外大量文獻(xiàn)報(bào)道，豬骨骼肌肌鈣蛋白Ⅰ（Porcine skeletal muscle troponin I，PsTnI）是豬肉所特有的一種蛋白質(zhì)，可以作為一種耐熱種類標(biāo)志蛋白（the

3、rmostable species marker protein），區(qū)分于其他熟肉制品的肉種類來源。
　　 本試驗(yàn)運(yùn)用原核表達(dá)系統(tǒng)獲得重組豬骨骼肌肌鈣蛋白Ⅰ，分別制備兔抗豬慢骨骼肌亞型肌鈣蛋白Ⅰ多克隆抗體和抗豬慢骨骼肌亞型肌鈣蛋白Ⅰ單克隆抗體，為今后建立檢測(cè)熟豬肉的夾心ELISA檢測(cè)方法提供可靠的生物學(xué)材料，尤其是檢測(cè)價(jià)值較高的牛肉制品中的摻假豬肉奠定良好的基礎(chǔ)。
　　 本研究的主要內(nèi)容包括：
　　 1．豬骨骼肌

4、TnI－fast/slow基因的克隆與表達(dá)。
　　 根據(jù)Genbank中收錄的Sus scrofa troponin Ⅰ（TNNI2）cDNA序列（DQ091303）和Sus scrofa troponin Ⅰ（TNNI1）cDNA序列（AY282922）分別設(shè)計(jì)合成了引物TnI－FP1/TnI-FP2和TnI－SP1/TnI-SP2，然后提取豬骨骼肌總RNA，利用RT-PCR方法擴(kuò)增到TnI－fast和TnI-slow基因并克

5、隆到pMD18-T載體上，對(duì)所得到的重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切分析及序列測(cè)定，BLAST比對(duì)結(jié)果：同源性達(dá)99％。分別構(gòu)建了TnI-fast和TnI－slow基因的原核表達(dá)質(zhì)粒（pKG-Tn1－fast、pKG－TnI-slow和pET-32a-TnI－fast），并在E．coli BL21（DE3）中成功獲得了表達(dá)，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS－PAGE電泳分析，分別出現(xiàn)了分子量大小為47KD、47KD和41KD的蛋白條帶，與預(yù)期融合蛋白GST-TnI

6、-FAST、GST-TnI－SLOW和HIS-TnI-SLOW的分子量大小一致。而且Western－blotting分析表明表達(dá)產(chǎn)物GST-TnI-FAST和GST-TnI－SLOW融合蛋白具有良好的生物學(xué)活性，為今后的研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
　　 2．兔抗豬慢骨骼肌亞型肌鈣蛋白Ⅰ多克隆抗體的制備與純化。
　　 將純化的重組蛋白GST－TnI－SLOW作為免疫原，通過設(shè)計(jì)好的免疫程序，成功制備了兔抗重組蛋白GST-TnI

7、－SLOW的高免血清。對(duì)所得高免血清分別采用飽和硫酸銨粗提和Sephadex G－200過柱純化，最后得到了純化的兔抗重組蛋白GST-TnI-SLOW IgG。
　　 3．抗豬慢骨骼肌亞型肌鈣蛋白Ⅰ單克隆抗體的制備與純化。
　　 將純化的融合蛋白GST-TnI－SLOW免疫BALB/c小鼠，制備免疫脾細(xì)胞，經(jīng)過細(xì)胞融合，分別用純化好的GST和HIS-TnI－SLOW作為篩選抗原進(jìn)行雙向負(fù)篩選和雙向正篩選，成功獲得了三株能

8、穩(wěn)定分泌抗TnI－SIOW蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞細(xì)胞株3C8，3H10，4H9。經(jīng)小鼠腹腔接種獲得的單抗效價(jià)均較高，3株針對(duì)HIS－TnI－SLOW的ELISA效價(jià)均在1：6.4×105以上，通過辛酸硫酸銨法提純獲得了純度較高的單克隆抗體。
　　 采用夾心ELISA方法來驗(yàn)證抗豬慢骨骼肌肌鈣蛋白Ⅰ（Porcine Skeletal TnI-SLOW McAb）單克隆抗體的特異性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明夾心ELISA對(duì)100℃，30m