優(yōu)質(zhì)肉雞脂肪沉積相關(guān)基因的篩選及其在前脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中的表達(dá)研究.pdf

1、為了研究?jī)?yōu)質(zhì)雞脂肪沉積的分子調(diào)控機(jī)制，本試驗(yàn)采用優(yōu)質(zhì)雞HS1系為試驗(yàn)材料，AA肉雞為對(duì)照，在個(gè)體和細(xì)胞水平上研究脂肪代謝相關(guān)基因的表達(dá)規(guī)律，以期找出調(diào)控脂質(zhì)代謝的候選基因，為優(yōu)質(zhì)雞的后續(xù)選育提供科學(xué)依據(jù)。
　　本試驗(yàn)選取了AA肉雞和優(yōu)質(zhì)雞HS1系21 d胚胎的肝臟組織進(jìn)行數(shù)字基因表達(dá)譜測(cè)序分析(DGE)，篩選出了品種間差異表達(dá)的基因，尤其是脂肪代謝相關(guān)基因，從轉(zhuǎn)錄組水平分析兩種雞脂肪代謝存在差異的遺傳機(jī)理;運(yùn)用Real-Time

2、PCR定量分析AA肉雞和優(yōu)質(zhì)雞HS1系在28 d、49 d和70 d時(shí)ACC、FAS、PGC-1α、PPARγSREBP-1c和PLIN1基因的表達(dá)，從個(gè)體水平上研究DGE所得結(jié)果;取12d的AA肉雞腹部脂肪，培養(yǎng)原代雞前脂肪細(xì)胞，分析ACC、FAS、PGC-1α、PPARγ、 SREBP-1c和PLIN1基因在脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中的表達(dá)規(guī)律，從細(xì)胞水平上探究候選基因在脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中的作用機(jī)制。
　　采用DGE技術(shù)對(duì)AA肉雞和優(yōu)

3、質(zhì)雞HS1系肝臟轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，每個(gè)文庫(kù)分別獲得了約690-957萬(wàn)個(gè)的表達(dá)標(biāo)簽，約685-950萬(wàn)個(gè)的Clean data;通過(guò)比對(duì)，鑒定出14977個(gè)基因，其中有1270個(gè)基因在P＜0.05水平上存在顯著差異，有493個(gè)基因在P＜0.01水平上存在差異極顯著。通過(guò)GO和Pathway分析，這些差異基因富集到細(xì)胞凋亡、細(xì)胞循環(huán)、鞘脂類(lèi)代謝、醚脂類(lèi)代謝、PPARs信號(hào)通路、脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路、mTOR信號(hào)通路和胰島素信號(hào)通路等生物學(xué)過(guò)程。

4、其中，有34個(gè)與脂代謝相關(guān)的基因在AA肉雞和優(yōu)質(zhì)雞HS1系間差異顯著，包括PPARγ和PLIN1等基因。脂肪代謝相關(guān)因子PPARγ和PLIN1在優(yōu)質(zhì)肉雞HS1系肝臟中的表達(dá)量分別是AA肉雞的3.79和5.42倍。此外，與PPARγ密切相關(guān)的幾個(gè)基因SREBP-1c、FAS、ACC和PGC-1α在AA肉雞和優(yōu)質(zhì)雞HS1系間也存在差異，其倍比分別為0.29、0.76、0.17和0.61。
　　定量分析AA肉雞和優(yōu)質(zhì)雞HS1系肝臟、腹脂

5、和皮脂中幾個(gè)候選基因，發(fā)現(xiàn)品種、日齡和組織因素對(duì)ACC、FAS、PGC-1α、PPARγ、 SREBP-1c和PLIN1基因的表達(dá)均存在較大影響，具體表現(xiàn)為除脂肪合成相關(guān)基因FAS外，其它五個(gè)基因在28d、49 d和70 d時(shí)在優(yōu)質(zhì)雞HS1系的肝臟和腹脂中的表達(dá)量均高于AA肉雞;隨著日齡的增加，ACC、FAS、PPARγ、 SREBP-1c和PLIN1在優(yōu)質(zhì)雞HS1系腹脂中的表達(dá)均呈先降低后升高趨勢(shì)，PGC-1α在兩種雞肝臟中均呈先增后

6、減趨勢(shì)，在腹脂中均呈不斷上升趨勢(shì);PGC-1α在肝臟中的表達(dá)量高于腹脂和皮脂，ACC、FAS、SREBP-1c、PPARγ和PLIN1均表現(xiàn)為在腹脂中表達(dá)量高于肝臟和皮脂。
　　此外，本試驗(yàn)進(jìn)行了雞前脂肪細(xì)胞的原代培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化。采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)組和對(duì)照組雞前體脂肪細(xì)胞都在36h時(shí)開(kāi)始大量增殖;60h時(shí)增殖速度達(dá)到最大;72h時(shí)細(xì)胞增殖速度下降。采用油紅O提取比色法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)脂肪含量，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)組和對(duì)照組前

7、脂肪細(xì)胞內(nèi)脂肪含量均在24 h較少，24 h后開(kāi)始大幅度增加，60 h時(shí)達(dá)到最高水平;72h時(shí)明顯下降，且表現(xiàn)為誘導(dǎo)后24 h開(kāi)始誘導(dǎo)組脂肪含量高于對(duì)照組。同時(shí)，對(duì)脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中對(duì)ACC、FAS、PGC-1α、PPARγ、SREBP-1c和PLIN1進(jìn)行定量分析，發(fā)現(xiàn)這些基因在的表達(dá)均表現(xiàn)為在48 h表達(dá)量最高，24 h和70 h表達(dá)量相對(duì)較低;且誘導(dǎo)分化48 h和70 h的表達(dá)量均為誘導(dǎo)組高于對(duì)照組。
　　本試驗(yàn)首次利用數(shù)字

8、基因表達(dá)譜技術(shù)全面篩選了AA肉雞和優(yōu)質(zhì)雞HS1系21 d胚胎肝臟中差異表達(dá)基因，鑒定出了14977個(gè)在AA肉雞和優(yōu)質(zhì)雞HS1系上表達(dá)的基因，其中1270個(gè)存在顯著差異。AA肉雞和優(yōu)質(zhì)雞HS1系生長(zhǎng)過(guò)程中，品種、日齡和組織因素對(duì)ACC、FAS、PGC-1α、PPARγ、 SREBP-1c和PLIN1基因的表達(dá)均存在較大影響。脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中ACC、SREBP-1c和PLIN1的表達(dá)在誘導(dǎo)分化后48h和70 h誘導(dǎo)組顯著高于對(duì)照組，F(xiàn)AS