秦川牛脂肪沉積相關(guān)基因篩選及可變剪接對基因表達和細胞定位的影響研究.pdf

1、脂肪組織不僅在個體發(fā)育過程中發(fā)揮必要作用，并且在牛肉品質(zhì)的研究中也扮演著重要角色。培育生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)牛肉的肉牛品種已成為目前分子育種的重要目標。牛肉中脂肪含量決定了牛肉的品質(zhì)。但由于脂肪組織形成和沉積的分子作用機制復雜，在牛上對脂肪沉積相關(guān)基因的研究相對較少，有待挖掘;并且基因的可變剪接豐富了其表達產(chǎn)物的種類，加大了基因作用機制的復雜程度，同時也為分子機制的研究提供了新思路，成為當今研究的熱點。為此，本研究對不同發(fā)育階段和不同性別秦川牛的皮下

2、脂肪組織進行轉(zhuǎn)錄組測序和基因差異表達分析，并在組織、細胞和分子水平上對差異表達基因逐步篩選得到脂肪沉積相關(guān)基因，最后利用電子克隆、基因組織表達譜構(gòu)建、脂肪細胞分化基因時序表達分析、細胞共定位及亞細胞定位分析等手段進一步研究了可變剪接的組織特異性以及可變剪接對脂肪沉積相關(guān)基因功能的影響。主要研究結(jié)果如下:
　　1.牛皮下脂肪組織轉(zhuǎn)錄組測序及基因表達分析
　　本研究利用二代高通量測序分別對胎牛、成年公牛、成年母牛和成年閹牛皮下脂

3、肪組織進行轉(zhuǎn)錄組測序。每個樣品獲得至少2，600萬clean reads，其中82.58％～84.41％的clean reads成功的比對到參考基因組上。我們共檢測了12，233個基因在四類皮下脂肪組織內(nèi)的表達，其中109個基因在四類皮下脂肪組織中共同高表達（≥500 RPKM）。共同高表達的基因中除了含有63個編碼核糖體蛋白的基因外，還包含多個與脂肪代謝相關(guān)的基因(APOE、GAPDH、FABP4、SPARC和ADIRF等)，說明共同

4、高表達的基因可以為篩選脂肪沉積相關(guān)基因提供材料。不同性別成年牛皮下脂肪組織基因表達高度相關(guān)（r≥0.91），胎牛和各成年牛皮下脂肪組織基因表達相關(guān)程度較低（r≤0.64）;并且通過對四類皮下脂肪組織兩兩比較差異基因數(shù)目統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)本研究中年齡相對性別對皮下脂肪組織基因的表達影響更大。此外，我們還在四類牛脂肪組織中檢測到大量新轉(zhuǎn)錄本，這為將來完善?；蚪M注釋及非編碼RNA的研究提供資源。
　　2.年齡和性別對脂肪組織基因表達差異的

5、影響
　　通過將成年公牛、成年母牛和成年閹牛皮下脂肪組織作為三個重復與胎牛皮下脂肪組織的基因表達進行比較，共檢測到2，703個差異表達基因(差異表達倍數(shù)＞2，P＜0.05)。成年牛和胎牛皮下脂肪組織差異基因GO(Gene ontology，基因功能注釋)富集分析顯示，差異基因顯著富集（P＜0.05）在與組織發(fā)育相關(guān)的GO條目;脂肪代謝相關(guān)的GO條目沒有顯著富集，但具有較低的P值。差異基因顯著富集在脂肪代謝關(guān)鍵信號通路PPAR pa

6、thway，其中促進脂肪沉積的基因在成年牛皮下脂肪組織中顯著上調(diào);另外，14個脂肪細胞成脂分化標志基因中有12個基因在成年牛皮下脂肪組織內(nèi)相對胎牛皮下脂肪組織高表達，說明成年牛皮下脂肪組織相對胎牛皮下脂肪組織進行著更為活躍的脂肪沉積。對成年公牛、成年母牛和成年閹牛皮下脂肪組織兩兩比較差異基因進行功能和參與的信號通路富集分析發(fā)現(xiàn)，差異基因在與甾類激素刺激、脂肪代謝和細胞因子相關(guān)的GO條目顯著富集，在和細胞因子相關(guān)的信號通路共同顯著富集，這

7、初步證明性別對牛皮下脂肪組織的脂肪代謝有影響，并且可能和細胞因子的分泌相關(guān)。
　　3.脂肪沉積相關(guān)基因的篩選
　　基于以上對轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的分析結(jié)果，選取11個在成年牛皮下脂肪組織內(nèi)均為胎牛皮下脂肪組織內(nèi)表達量10倍以上的基因和20個在四類牛皮下脂肪組織內(nèi)共同高表達的基因，作為后續(xù)逐步篩選與脂肪沉積相關(guān)基因的初始材料。通過構(gòu)建31個候選基因的組織表達譜，發(fā)現(xiàn)其中12個基因(ADIPOR2、CIDEC、GHR、LIPE、S10

8、0B、SCD、THRSP、TUSC5、ANXA2、CST3、SPARC和VIM)在脂肪組織內(nèi)相對其它組織高表達。通過羅格列酮對牛原代脂肪細胞進行脂肪沉積誘導，檢測到其中7個基因(GHR、THRSP、SCD、LIPE、TUSC5、CIDEC和CST3)在脂肪沉積過程中表達呈上調(diào)趨勢。利用腺病毒在牛原代脂肪細胞中超表達PPARG2，檢測到其中3個基因(CIDEC、TUSC5和CST3)表達量顯著上調(diào)。最終，本實驗篩選出3個受PPARG2調(diào)控

9、且與脂肪沉積相關(guān)的基因，同時補充了牛PPARG2基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
　　4.脂肪組織內(nèi)表達基因可變剪接特征分析
　　在以上轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)中共發(fā)現(xiàn)4，753個基因存在可變剪接現(xiàn)象，占總檢測基因數(shù)目的38.85％。但只有1，319(28％)個基因在四類牛脂肪組織中均出現(xiàn)可變剪接現(xiàn)象，并且共同出現(xiàn)可變剪接的基因只有17％的可變剪接事件在四類牛脂肪組織內(nèi)同時存在，說明可變剪接在脂肪組織的不同發(fā)育時期或不同性別的個體內(nèi)存在較大差異。本研

10、究選擇牛NFIX基因?qū)勺兗艚拥慕M織特異性進行了進一步驗證。通過電子克隆及PCR方法成功預測并驗證牛NFIX基因存在5種不同轉(zhuǎn)錄本。組織表達譜分析顯示不同轉(zhuǎn)錄本在牛不同發(fā)育時期和不同組織內(nèi)表達出現(xiàn)多樣化的差異。以上分析說明同一基因的不同亞型可能會具有不同功能，因此有必要進一步分析可變剪接對脂肪沉積相關(guān)基因表達和分布的影響。
　　5.脂肪沉積相關(guān)基因可變剪接模式及細胞定位分析
　　本實驗分析了三個脂肪沉積相關(guān)基因（CEBPA、

11、CIDEC和TUSC5）的可變剪接模式，并通過細胞定位分析或細胞共定位分析在239T或3T3-L1細胞中檢測可變剪接對以上三個基因在細胞內(nèi)的表達分布影響。結(jié)果顯示:CEBPA的兩種蛋白亞型均分布在細胞核內(nèi);CIDEC的兩種蛋白亞型均分布在細胞質(zhì)內(nèi)，并且在細胞質(zhì)內(nèi)的分布未發(fā)現(xiàn)差異;TUSC5的兩種蛋白亞型均分布在細胞質(zhì)內(nèi)，但在細胞質(zhì)內(nèi)的分布出現(xiàn)明顯差異。對TUSC5產(chǎn)生的兩種蛋白亞型氨基酸序列進一步分析顯示，可變剪接可能通過改變TUSC5

12、的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號影響其在細胞質(zhì)內(nèi)的分布。
　　6.可變剪接對脂肪沉積相關(guān)基因TUSC5作用的影響
　　對TUSC5不同亞型(TUSC5a和TUSC5b)的組織表達譜和在牛原代脂肪細胞誘導分化不同階段表達變化趨勢分析，均發(fā)現(xiàn)TUSC5a和TUSC5b存在一定的差異;并且利用細胞定位載體檢測TUSC5a和TUSC5b在293T細胞內(nèi)的時序表達，發(fā)現(xiàn)TUSC5a相對TUSC5b出現(xiàn)明顯的遲緩表達。但亞細胞定位分析顯示TUSC5a和