機械拉伸對成骨細胞基因表達及可變剪接的研究.pdf

1、人體內許多組織和器官都受到來自生理環(huán)境的不同類型和大小的應力作用,骨是人體內重要的結構和功能組織,研究應力作用對骨組織生長發(fā)育的影響有助于骨組織修復工程的發(fā)展。應力刺激可以改變細胞內基因的表達和可變剪接過程,本文利用生物力學、分子生物學等手段研究拉伸刺激對成骨細胞內力響應基因的表達和可變剪接的影響,以及可能的可變剪接調控機制。
　　主要研究內容和結果如下:
　　培養(yǎng)小鼠成骨細胞株MC3T3-E1和人永生化表皮細胞株HaCaT

2、,倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)良好,MC3T3-E1細胞呈纖維樣細胞型,HaCaT細胞呈上皮樣細胞型。
　　將成骨細胞 MC3T3-E1接種到硅橡膠膜上,應用自主設計制作的應力拉伸裝置對MC3T3-E1細胞施加拉伸刺激,加載參數為:應變量15％、頻率30次/min、加載時間分別為3h和6h,收集細胞提取總mRNA和蛋白,研究拉伸刺激對VEGF、CD44和cyclinD1基因表達的影響。RT-PCR檢測發(fā)現拉伸前后VEGF基因主要表

3、達剪接變異體VEGF188、VEGF164和VEGF120,CD44基因主要表達剪接變異體CD44S和CD44E,cyclinD1基因主要表達剪接變異體cyclinD1a。利用q-PCR和western blot檢測表達量變化發(fā)現拉伸刺激后VEGF及其剪接變異體VEGF164和VEGF120表達量明顯上調,cyclinD1及其剪接變異體cyclinD1a表達量明顯下調,而CD44及其剪接變異體CD44S和CD44E表達量改變不明顯。

4、r>　　構建剪接因子 ASF/SF2、SC35和 hnRNPA1的真核表達質粒 pcDNA3.1(+)-EGFP-ASF/SF2、pcDNA3.1(+)-EGFP-SC35和pcDNA3.1(+)-EGFP-hnRNPA1,轉染HaCaT細胞以模擬拉伸刺激后細胞內剪接因子ASF/SF2、SC35和hnRNPA1表達上調的狀態(tài),研究應力拉伸環(huán)境下剪接因子ASF/SF2、SC35和hnRNPA1對VEGF基因可變剪接的影響。熒光顯微鏡下觀察