肝臟不同類型細(xì)胞基因表達(dá)及可變剪接的研究.pdf

1、肝臟是人體中最大的實(shí)質(zhì)性器官，主要負(fù)責(zé)著體內(nèi)脂類、糖類、蛋白質(zhì)、和維生素等眾多物質(zhì)的代謝，是人體中的代謝工廠。此外，肝臟在體內(nèi)還發(fā)揮著解毒、免疫、存儲糖原和維生素、合成膽汁以及造血等功能，被稱之為體內(nèi)最繁忙的器官。肝臟的復(fù)雜功能的發(fā)揮依賴于組成肝臟的各種類型的細(xì)胞，肝臟細(xì)胞主要分成兩類:肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞(HC)和非實(shí)質(zhì)細(xì)胞(NPC)。前者是肝臟中最主要的細(xì)胞類型，占據(jù)肝臟體積約80％，發(fā)揮著肝臟中的絕大部分功能。非實(shí)質(zhì)細(xì)胞主要包括肝竇內(nèi)皮細(xì)胞

2、(LSEC)、枯否細(xì)胞(KC)、肝星狀細(xì)胞(HSC)以及其他一些免疫細(xì)胞等。目前，對肝臟細(xì)胞的研究往往集中于某一種類型的細(xì)胞。
　　本研究同時(shí)構(gòu)建了多種類型細(xì)胞的基因表達(dá)譜，通過肝臟細(xì)胞水平表達(dá)譜的全面解析，系統(tǒng)地發(fā)現(xiàn)肝臟細(xì)胞中表達(dá)的新基因或新亞型，深入地了解肝臟不同類型細(xì)胞的共性與特性，全新地認(rèn)識細(xì)胞在肝臟器官中的分工與協(xié)作。
　　轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組作為基因組后繼補(bǔ)充研究對象，分別擔(dān)當(dāng)傳遞遺傳信息和功能最終執(zhí)行的角色。而蛋白

3、質(zhì)組鑒定覆蓋度的范圍往往是參照編碼基因的數(shù)目，因此可尋求轉(zhuǎn)錄組水平的mRNA鑒定輔助蛋白質(zhì)組的深度覆蓋。除了覆蓋度的優(yōu)勢以外，轉(zhuǎn)錄組水平在靈敏度和準(zhǔn)確性方面具有無可比擬的優(yōu)勢，還可以更精確地鑒定到基因的可變剪接、RNA編輯等信息。目前，轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-Seq)作為一項(xiàng)新一代測序技術(shù)，能在全基因組范圍內(nèi)以單堿基分辨率檢測并定量轉(zhuǎn)錄片段，成為研究轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜的重要方法。
　　首先，我們首次構(gòu)建了肝臟細(xì)胞水平的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜。以C57

4、BL/6小鼠動物為模型，采用流式細(xì)胞術(shù)完成肝臟3種類型細(xì)胞（HC、LSEC和KC）的分選，確保各類細(xì)胞純度和活性分別達(dá)到95％和85％以上。對細(xì)胞提取的RNA，利用新一代測序RNA-Seq技術(shù)，每種類型細(xì)胞得到3G以上的數(shù)據(jù)量，滿足深度測序目的。通過數(shù)據(jù)低質(zhì)量過濾、讀段定位、轉(zhuǎn)錄本重構(gòu)、表達(dá)定量以及質(zhì)量控制等一系列的數(shù)據(jù)處理，完成了肝臟不同類型細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的定性和定量分析。在假發(fā)現(xiàn)率(FDR)5％的標(biāo)準(zhǔn)下，HC、LSEC和KC分別鑒定到了

5、8802、10789和10125個(gè)基因，其中細(xì)胞特異表達(dá)基因分別是504、851和498個(gè)?；虮磉_(dá)豐度的相關(guān)性分析顯示HC與肝臟組織之間的相關(guān)系數(shù)最高，兩類非實(shí)質(zhì)細(xì)胞之間相關(guān)次之。這體現(xiàn)了HC在肝臟細(xì)胞中占絕大部分比例的事實(shí)，是最能夠代表肝臟組織的細(xì)胞類型。
　　其次，基于肝臟細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜，我們完成了不同類型細(xì)胞系統(tǒng)的功能注釋分析。其一，我們將各細(xì)胞表達(dá)基因根據(jù)豐度分成低、中和高表達(dá)組。通過功能富集分析，不同類型細(xì)胞存在共

6、性:低表達(dá)組基因功能富集細(xì)胞粘附，基因集中于膜與細(xì)胞表面;中表達(dá)基因富集轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及RNA加工等，而高表達(dá)基因則在翻譯、蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)以及能量代謝方面。說明了細(xì)胞水平上參與同一生物學(xué)過程的基因其表達(dá)水平亦相似的普遍規(guī)律。其二，針對3種類型細(xì)胞顯著高表達(dá)基因作GO功能富集分析，結(jié)果顯示細(xì)胞顯著高表達(dá)基因能夠較好地表征各自細(xì)胞的生物學(xué)特性。例如，HC顯著富集于氧化還原反應(yīng)、各種代謝過程;KC作為肝臟中的巨噬細(xì)胞，富集條目則集中在免疫應(yīng)答、損

7、傷應(yīng)答以及炎癥反應(yīng)等;而LSEC內(nèi)血管發(fā)育、細(xì)胞分化調(diào)控與已報(bào)道的LSEC在肝再生中的重要作用相關(guān)。其三，細(xì)胞特異表達(dá)基因和共同表達(dá)基因在豐度分布和功能富集方面差異明顯。細(xì)胞特異基因偏向于低豐度，位于細(xì)胞表面和膜位置，功能集中于小分子代謝以及細(xì)胞特殊的一些生物學(xué)功能。而共同表達(dá)基因富集于大分子代謝過程，集中在胞內(nèi)亞細(xì)胞器分布。利用細(xì)胞特異表達(dá)基因進(jìn)行通路富集分析，我們發(fā)現(xiàn)肝臟中很多生物學(xué)過程涉及不同類型細(xì)胞的協(xié)同作用。其四，各細(xì)胞內(nèi)基因

8、表達(dá)豐度的無監(jiān)督聚類結(jié)果揭示不同類型細(xì)胞具有顯著不同的基因表達(dá)模式，細(xì)胞富集表達(dá)的基因簇表明了各自的生物學(xué)特征。
　　再次，我們系統(tǒng)地鑒定了肝臟不同類型細(xì)胞內(nèi)的可變剪接以及細(xì)胞之間的可變剪接差異。HC、LSEC和KC即使都同屬于肝臟，但來源屬性均不同，HC屬于上皮細(xì)胞，LSEC為內(nèi)皮細(xì)胞，KC則是屬于髓系細(xì)胞。以肝臟細(xì)胞為代表，我們第一次解析了細(xì)胞水平的剪接差異，對于揭示不同細(xì)胞為完成各自功能選擇性表達(dá)不同剪接體具有重要意義。通過

9、RNA-Seq數(shù)據(jù)重新拼接組裝轉(zhuǎn)錄本，除了數(shù)據(jù)庫已知轉(zhuǎn)錄本的鑒定，我們還發(fā)現(xiàn)了20％以上的新轉(zhuǎn)錄本，對應(yīng)著不同的可變剪接方式。在3種類型細(xì)胞中，外顯子跳躍均是最廣泛的剪接形式。新轉(zhuǎn)錄本的鑒定及部分驗(yàn)證，豐富了對應(yīng)基因的注釋。另外，通過不同細(xì)胞之間的可變剪接事件比較，我們首次發(fā)現(xiàn)肝臟細(xì)胞之間存在著大量“switching-like”的剪接差異，不同細(xì)胞對于同一基因偏好表達(dá)不同的可變剪接體，以滿足各細(xì)胞的功能需求。這一事實(shí)也得到了qPCR實(shí)

10、驗(yàn)的證明。此外，我們嘗試從剪接因子的角度解釋了細(xì)胞之間剪接差異形成的可能原因。
　　最后，我們以肝臟組織為例，采取轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)的整合策略，鑒定新蛋白產(chǎn)物，優(yōu)化了基因組注釋。我們同時(shí)產(chǎn)出了肝臟組織的RNA-Seq數(shù)據(jù)和質(zhì)譜數(shù)據(jù)。將轉(zhuǎn)錄組水平得到的可變剪接、RNA編輯和新編碼基因信息擴(kuò)充至已知蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建了肝臟組織特異的個(gè)性化蛋白質(zhì)序列庫。經(jīng)過質(zhì)譜數(shù)據(jù)檢索，在FDR小于1％的水平下，我們共鑒定到150個(gè)薪肽段，對應(yīng)7

11、2個(gè)新可變剪接體、15個(gè)RNA編輯位點(diǎn)以及43個(gè)可能的新編碼基因區(qū)。并且，隨機(jī)選取了11個(gè)新肽段對應(yīng)的轉(zhuǎn)錄本均得到了PCR和傳統(tǒng)Sanger測序的證實(shí)。雙組學(xué)水平上發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證的高可信新基因產(chǎn)物展示了我們方法的有效性。
　　綜上所述，我們首次構(gòu)建了肝臟不同類型細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜，這是目前基于細(xì)胞水平的最大的小鼠肝臟轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)，為研究肝臟細(xì)胞功能提供了一個(gè)全面的參考資源。通過對不同細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組系統(tǒng)全面的功能富集分析，解析了肝臟不同類型