肌萎縮側索硬化轉(zhuǎn)基因鼠模型腰髓差異表達基因及可變剪接研究.pdf

1、肌萎縮側索硬化(Amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是一種最常見的成人發(fā)病的神經(jīng)退變性疾病,其特征是脊髓、腦干及運動皮質(zhì)上、下運動神經(jīng)元進行性及相對選擇性的退變。病人表現(xiàn)為進行性的癱瘓與肌肉萎縮,約半數(shù)在發(fā)病3～5年內(nèi)死亡,死因多為呼吸衰竭。每年全球發(fā)病率約為(1～2)/100000,其終生發(fā)病率約為1/600至1/2000。
　　 90％的ALS病例為散發(fā)性,其余10％為家族性,二者的臨床表現(xiàn)及

2、病理特點難以區(qū)分。20％的家族性病例與細胞質(zhì)中銅/鋅超氧化物歧化酶(SOD1)發(fā)生的某種基因突變相關聯(lián)。這種SOD1基因突變屬于發(fā)揮主導作用的錯義突變,致使一種氨基酸被另一種氨基酸所替代,例如甘氨酸被丙氨酸所替代(SOD1-G93A)。因為表達人SOD1突變的動物亦在成年期發(fā)病,且臨床表現(xiàn)及病理特點與人類患者非常相似,故這種轉(zhuǎn)基因動物已成為廣泛采用的ALS動物模型。實際上,絕大多數(shù)的突變SOD1并未影響酶學活性,其引發(fā)的病理效應可能源于

3、生物學功能方面的毒性獲得。盡管在對ALS深入研究的基礎上,學者們提出了解釋SOD1突變效應的幾種假說,包括氧化應激、谷氨酸毒性、大分子聚集體形成、線粒體功能失調(diào)及凋亡等假說,但是,目前人們對SOD1突變促發(fā)ALS的確切機制依然所知甚少。
　　 高效的基因組學技術為闡釋復雜的疾病發(fā)病機制及其調(diào)控提供了寶貴的機遇。mRNA轉(zhuǎn)錄本的可變剪接是轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的重要形式,它將mRNA前體中的內(nèi)含子選擇性移除,同時將外顯子組合連接成多種形式的成

4、熟RNA。數(shù)量有限的基因可擴展表達為非常復雜的蛋白質(zhì)組,因此可變剪接在產(chǎn)生蛋白質(zhì)組學的多態(tài)性方面發(fā)揮著重要的作用。據(jù)估算,在所有的人類基因中發(fā)生可變剪接者約占3/4。目前資料顯示,90％以上的人類基因發(fā)生了可變剪接。ASTD數(shù)據(jù)庫(http://www.ebi.ac.uk)資料顯示57％的小鼠基因發(fā)生可變剪接。研究者越來越認識到mRNA剪接在許多重要的生理過程如發(fā)育、生理和疾病中,發(fā)揮著主導作用。Affymetrix外顯子芯片迅速獲得業(yè)

5、界認可并成為同時檢測基因水平和外顯子水平表達的操作標準。
　　 新近的研究表明可變剪接在神經(jīng)系統(tǒng)尤其普遍。已有報道ALS中TARDNA-結合蛋白43(TDP-43)的異常剪接可增加聚集和細胞毒性作用。嚙齒類動物中的谷氨酸轉(zhuǎn)運體1(在人類稱為EAAT2)以一種復雜的模式發(fā)生可變剪接,包括5'端與3'非翻譯區(qū)及幾個編碼區(qū)異構體。盡管可變剪接在神經(jīng)系統(tǒng)普遍存在,但在ALS中的研究甚少。
　　 本研究應用Affymetrix小鼠

6、外顯子1.0 ST芯片來檢測SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠及其同窩同性別非轉(zhuǎn)基因?qū)φ談游镅杌虻牟町惐磉_與外顯子的可變剪接,并通過RT-PCR方法對上述檢測結果進行驗證。每張芯片大約包含5.4兆個探針(1.4兆個探針組),覆蓋了約1百萬個已知的和預測的外顯子。大約90％的外顯子被4個探針所覆蓋,這些針對同一個外顯子設計的探針組成的集合稱為探針組(probesets)。對每一個基因而言,平均的探針數(shù)是30～40個,通常分布于整個轉(zhuǎn)錄本序列

7、的全長。上述外顯子芯片可整合每一個已知的和預測的外顯子的表達,為研究可變剪接(外顯子表達分析)提供了強有力的工具,同時可對基因水平的表達進行分析。
　　 本研究首次對SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠的腰髓進行了外顯子芯片分析,以確定在突變SOD1存在的情況下差異表達基因及可變剪接事件。本課題分為三部分。
　　 第一部分肌萎縮側索硬化轉(zhuǎn)基因鼠模型腰髓差異表達基因研究
　　 目的:研究在突變SOD1存在的情況下,G93A

8、轉(zhuǎn)基因小鼠腰髓組織的基因表達譜。
　　 方法:應用Affymetrix小鼠外顯子1.0 ST芯片檢測發(fā)病期的雌性SOD1-G93A小鼠及非轉(zhuǎn)基因同性別的同窩對照小鼠腰髓組織的基因轉(zhuǎn)錄本,并對差異表達基因進行分層聚類分析、GO分類及生物學通路分析。
　　 結果:(1)在突變SOD1蛋白存在的情況下,有322個轉(zhuǎn)錄本的差異表達具有統(tǒng)計學意義,其中309個(占95.96％)上調(diào),13個(占4.04％)下調(diào)?；赥檢驗的結果,經(jīng)

9、可視化處理生成一個火山圖以對比發(fā)病組與對照組之間的差異表達基因。(2)通過分層聚類分析,我們可見各樣品之間有很好的可重復性,而且發(fā)病組與對照組之間的基因可成功區(qū)分。(3)GO分類。對這些發(fā)生差異表達的基因根據(jù)其分子功能進行了分類,其中滿足P值＜0.001的上述基因類別包括肝素結合、胰島素樣生長因子1結合、超氧化物引發(fā)的NADPH氧化活性、整合素結合、脂蛋白酯酶活性及化學因子活性等。從差異表達基因的生物學過程考慮,主要涉及細胞黏附、炎癥反

10、應及免疫反應。同時還涉及白細胞黏附、整合素復合體、整合素介導的信號途徑以及MAPK活性等。(4)生物學通路分析?；贙EGG數(shù)據(jù)庫分析,差異表達基因主要涉及如下生物學通路:細胞因子及其受體相互作用、actin細胞骨架調(diào)節(jié)、自然殺傷細胞介導的細胞毒作用、細胞黏附、補體及凝血瀑布、白細胞跨內(nèi)皮遷移、細胞黏附分子及凋亡等。
　　 結論:肌萎縮側索硬化模型SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠腰髓組織的基因表達與非轉(zhuǎn)基因同性別的同窩對照小鼠相比,

11、具有顯著的統(tǒng)計學差異,且發(fā)生差異表達的基因可明確區(qū)分并進行相應的歸類與分析。
　　 第二部分肌萎縮側索硬化轉(zhuǎn)基因鼠模型腰髓可變剪接研究
　　 目的:研究在突變SOD1存在的情況下,G93A轉(zhuǎn)基因小鼠腰髓組織的可變剪接。
　　 方法:應用小鼠外顯子1.0 ST芯片檢測發(fā)病期的雌性SOD1-G93A小鼠及非轉(zhuǎn)基因同性別的同窩對照小鼠的腰髓組織的可變剪接事件,并對可變剪接基因進行分層聚類分析、GO分類及生物學通路分析。

12、
　　 結果:(1)在全部44087個探針組中,有333個探針組符合質(zhì)量控制標準,可用于后繼的分析處理。這些探針組分屬于297個發(fā)生可變剪接的基因,提示單個轉(zhuǎn)錄本可能發(fā)生多個可變剪接事件。我們的研究結果顯示,有63個發(fā)生可變剪接的外顯子源于27個轉(zhuǎn)錄本。在多個編碼蛋白的轉(zhuǎn)錄本中檢測到3個或3個以上出現(xiàn)可變剪接的外顯子,提示了小鼠體內(nèi)剪接調(diào)控模式的復雜性。(2)根據(jù)其相似性用聚類分析3.0軟件進行了HC分析。結果顯示兩組間具有良好

13、的相關性。(3)剪接基因GO分類。根據(jù)其分子學功能分類,這些發(fā)生可變剪接的基因主要涉及鐵離子結合、化學因子活性、基質(zhì)金屬蛋白酶活性及分子活性。而從生物學過程考慮,這些基因主要與炎癥反應、免疫反應、趨化作用、MAPK活性的活化及抗凋亡等相關。(4)生物學路徑分析。以KEGG數(shù)據(jù)庫分析為基礎,發(fā)現(xiàn)297個可變剪接基因中的95個與已知的生物學路徑相關,并且鑒定出其中具有統(tǒng)計學差異的通路,包括細胞因子及其受體的相互作用、MAPK信號路徑、細胞黏

14、附分子、actin細胞骨架的調(diào)控、細胞凋亡、T細胞受體信號路徑及自然殺傷細胞介導的細胞毒等。
　　 結論:單個轉(zhuǎn)錄本可能發(fā)生多個可變剪接事件,提示了小鼠體內(nèi)剪接調(diào)控模式的復雜性。發(fā)生可變剪接的基因與發(fā)生差異表達的基因相比,雖然重疊部分很少,但其GO歸類與生物學通路重疊比例很高,提示相應的生物學效應受到轉(zhuǎn)錄表達與外顯子剪接兩個水平的共同調(diào)控。
　　 第三部分肌萎縮側索硬化轉(zhuǎn)基因鼠模型腰髓差異表達基因及可變剪接的驗證研究

15、r>　　 目的:驗證在突變SOD1存在的情況下,G93A轉(zhuǎn)基因小鼠腰髓組織的差異表達基因及可變剪接事件。
　　 方法:應用RT-PCR方法對發(fā)病G93A轉(zhuǎn)基因小鼠及其同窩對照的腰髓組織中感興趣差異表達基因及可變剪接進行驗證。
　　 結果:發(fā)病動物腰髓樣本中CD68抗原(CD68 antigen,CD68)與脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase,LPL)的mRNA表達水平明顯增高(P＜0.001),提示在疾病

16、的早期階段存在炎癥反應與脂類高代謝狀態(tài)。我們也對ALS中程序性細胞死亡1(programmed cell death1,PDCD1)mRNA轉(zhuǎn)錄本的可變剪接進行了RT-PCR驗證。結果表明包含外顯子2的異構體主要存在于發(fā)病動物,而不含外顯子2的異構體主要存在于對照組。芯片預測發(fā)生可變剪接與不發(fā)生可變剪接的外顯子均通過RT-PCR得以證實。
　　 結論:上述結果證實了外顯子芯片技術的可靠性與敏感性,其可用以檢測基因水平及外顯子水平