不同類型玉米自交系胚乳發(fā)育關(guān)鍵時期差異表達基因的分離與克隆.pdf

1、玉米胚乳占籽粒重量的80％以上，胚乳細胞的發(fā)育、增殖和充實狀況決定著籽粒的重量和品質(zhì)。前人對玉米籽粒胚乳的研究主要集中在籽粒淀粉的特性及其合成過程中關(guān)鍵酶的作用方面，對籽粒胚乳不同時期發(fā)育機理，特別是分子機理的認識還十分有限。本研究以粒重差異較大的爆裂玉米自交系N04和馬齒型普通玉米自交系丹232為材料，在研究其籽粒灌漿進程的基礎(chǔ)上，確定胚乳發(fā)育關(guān)鍵時期，采用抑制差減雜交技術(shù)，批量克隆了兩個自交系胚乳發(fā)育關(guān)鍵時期差異表達的EST，并對部

2、分EST進行了差異表達驗證、電子定位和比較基因組學(xué)分析。另外，還克隆了一個GTP結(jié)合蛋白的Arf家族基因的全長cDNA序列，并分析了其在N04胚乳發(fā)育過程中的表達情況和組織特異性。研究結(jié)果不僅有助于挖掘不同類型玉米胚乳發(fā)育相關(guān)基因，揭示胚乳發(fā)育和籽粒形成的分子機理，更重要的是為粒重候選基因的挖掘、以及利用基因工程方法提高粒重和改良品質(zhì)提供了新基因貯備、高水平的材料平臺和理論依據(jù)。 主要結(jié)果如下： 1.采用Richards

3、方程擬合小粒爆裂玉米自交系N04和大粒馬齒型普通玉米自交系丹232籽粒灌漿過程，結(jié)果表明，自交系N04的起始生長勢較大，最大灌漿速度較小，到達最大灌漿速度的時間較早；自交系丹232的起始生長勢小，最大灌漿速度較大，到達最大灌漿速度的時間較晚，活躍生長期較長，平均灌漿速率和最大灌漿速率時的百粒重較大，說明兩個自交系籽粒灌漿過程中各種代謝活動差異較大。從胚乳、胚、果皮的鮮重和干重的動態(tài)變化可以看出，授粉后10d(10DAP)至20d(20D

4、AP)是胚乳發(fā)育的關(guān)鍵時期。兩個自交系胚乳發(fā)育的顯微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，N04和丹232在10 DAP處于細胞分裂階段，之后胚乳細胞內(nèi)含物快速增長，20 DAP胚乳細胞充滿淀粉粒。N04胚乳發(fā)育成硬質(zhì)型，丹232胚乳發(fā)育成粉質(zhì)型，兩個自交系的胚乳結(jié)構(gòu)存在較大差異。綜合考慮以上研究結(jié)果，確定選取兩個自交系10 DAP和20 DAP兩個關(guān)鍵時期的胚乳進一步研究其差異表達基因。 2.利用抑制差減雜交方法，分別構(gòu)建了自交系NO4和丹232 1

5、0 DAP和20 DAP胚乳的正反向4個抑制差減雜交庫，分別富集了N04胚乳早期、NO4胚乳中期、丹232胚乳早期和丹232胚乳中期增強表達的基因。對其進行反向Northern雜交驗證后測序，獲得902個非重復(fù)序列。用BioEdit和ClustalW軟件分別進行多序列的重疊分析，共得到344個UniqueESTs，包括204個Contigs和140個Singletons。根據(jù)Blastx分析結(jié)果，去除4個差減文庫之間的重復(fù)序列，共得到了

6、160個不同的EST序列，推測其編碼的蛋白質(zhì)與其他物種已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列具有很高的相似性，有20％的差異表達基因為功能未知或新發(fā)現(xiàn)的EST。功能已知的EST涉及代謝途徑的多個方面，包括20％的基礎(chǔ)代謝、5.21％的轉(zhuǎn)錄及其調(diào)控(包括3.75％的轉(zhuǎn)錄因子)、2.6％的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、3％的細胞生長和分裂、26.04％的蛋白加工和5.73％的物質(zhì)運輸?shù)认嚓P(guān)基因。 3.利用電子定位和比較基因組學(xué)的方法將差異表達EST定位到玉米染色體上，

7、并與前人定位的粒重QTL位點進行了比較分析。70條定位上的ESTs分布在玉米十條染色體上，其中第4染色體上定位的ESTs最多，占24.29％，第10染色體上定位的ESTs最少，占2.86％。9條ESTs位于已定位粒重QTL所在的標記區(qū)間，占總定位ESTs的12.9％，并分別位于第1、2、3、6、7和8染色體上。兩條ESTs PEl2C5和PEl5C3共同定位到利用與本研究相同的兩個自交系定位百粒重QTL的標記區(qū)間，推測其分別編碼鋅指家族

8、蛋白和GTP結(jié)合蛋白。 4.采用電子克隆結(jié)合RT-PCR的方法驗證、分離克隆了一個GTP結(jié)合蛋白的全長eDNA序列。序列長938 bp，編碼區(qū)609 bp，5'-非編碼區(qū)有237 bp，3'-非編碼區(qū)有89 bp，編碼202個氨基酸的蛋白質(zhì)。該蛋白質(zhì)分子量為22.77 KD，等電點是6.13，前15個氨基酸為信號肽序列，具有小G蛋白Arf家族基因的結(jié)構(gòu)域，同時還含有ABC轉(zhuǎn)運蛋白的結(jié)構(gòu)域。該基因在自交系N04胚乳發(fā)育早期表達量