壓力對(duì)大鼠纖維環(huán)細(xì)胞自噬與線粒體損傷應(yīng)激的影響.pdf

1、目的:程序性細(xì)胞死亡在椎間盤退變中發(fā)揮重要作用,但自噬及自噬性細(xì)胞死亡在椎間盤退變中的發(fā)生機(jī)制及具體作用尚不明確。本研究通過構(gòu)建鼠纖維環(huán)細(xì)胞體外培養(yǎng)體系,探討壓力對(duì)鼠纖維環(huán)細(xì)胞自噬與線粒體損傷應(yīng)激的影響,分析自噬及自噬性細(xì)胞死亡在椎間盤退變中的可能發(fā)生機(jī)制與作用。
　　方法:(1)分離、培養(yǎng)大鼠纖維環(huán)細(xì)胞并傳代,觀察其形態(tài)及生物學(xué)特性,通過甲苯胺藍(lán)染色,倒置相差顯微鏡對(duì)細(xì)胞表型進(jìn)行鑒定。(2)取第1代生長(zhǎng)良好的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液后

2、種培養(yǎng)皿或6孔板,培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)1天后分為實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組置于可控壓力培養(yǎng)裝置中在1MPa壓力下分別培養(yǎng)12h、24h、36h、48h,對(duì)照組置于37℃、5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。(3)采用JC-1熒光染色,流式細(xì)胞儀檢測(cè)線粒體膜電位去極化水平反映線粒體損傷程度;用紅色熒光降低百分比表示線粒體膜電位降低。(4)MDA、SOD試劑盒檢測(cè)線粒體內(nèi)MDA含量與SOD活性反應(yīng)線粒體氧化應(yīng)激水平。(5)取36h實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組用倒置相

3、差顯微鏡觀察對(duì)比細(xì)胞死亡數(shù)。(6)Western Blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3B-I、LC3B-II的表達(dá)以反映細(xì)胞自噬水平。
　　結(jié)果:(1)成功構(gòu)建鼠纖維環(huán)細(xì)胞體外培養(yǎng)模型,細(xì)胞形態(tài)為梭形或多角形,原代細(xì)胞生長(zhǎng)較慢,第1代與第2代生長(zhǎng)較快,第3代及以后變慢。細(xì)胞呈甲苯胺藍(lán)異染性,染色后倒置相差顯微鏡觀察示胞核空泡狀,典型者胞核藍(lán)色,胞漿紫色,可見核分裂像。(2)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組隨著加壓培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)(0

4、h-48h),JC-1熒光染色示紅光百分比越低,表明隨著加壓時(shí)間增加,線粒體損傷加重。(3)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組隨著加壓培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)(0h-48h),MDA含量越高,SOD活性越低,表明隨著加壓時(shí)間增加,線粒體氧化應(yīng)激水平增高。(4)倒置相差顯微鏡示36h實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組細(xì)胞死亡數(shù)明顯增多。(5)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組隨著加壓培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)(0h-48h),Beclin-1的表達(dá)水平越高,LC3B-I/LC3B-II的比值越低,表明隨著加壓時(shí)間增加,